hBMP2修饰的β-TCP/胶原支架对MC3T3-E1细胞分化的影响①

阮 蔷，赵 刚，肖 月，孙佳宁

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154003)



hBMP2修饰的β-TCP/胶原支架对MC3T3-E1细胞分化的影响①

阮 蔷，赵 刚，肖 月，孙佳宁

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：构建含hBMP2(Human Bone morphogenetic proteins2，hBMP2)质粒DNA的β-TCP/胶原(β-Tricalcium Phosphate/Collagen β-TCP/胶原)支架材料，并研究其对MC3T3-E1细胞分化的影响。方法：制备纳米级多孔β-TCP/胶原支架并负载含BMP2目的基因的质粒DNA形成基因修饰的支架材料。建立MC3T3-E1细胞株与复合支架的体外培养体系。将其分为支架组和平皿组，再根据质粒的不同浓度每组再分为4个小组。复合培养后取样通过扫描电镜和光镜进行细胞形态学观察；1、3、7、14dALP活性检测测量细胞碱性磷酸酶的活性，1、3、7、14d茜素红染色观察，实时荧光定量PCR检测细胞周期1、3、7、14d观察Runx2、OCN、ALP、OPN因子,检测结果处理并进行统计学分析。结果：含hBMP2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复合材料上细胞黏附数、分化数量及材料表面分布都高于单纯含hBMP2为目的基因的质粒DNA，具有统计学意义(P<0.05)，通过用碱性磷酸酶活性ALP、茜素红染色检测结果显示支架组对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响优于平皿组，具有统计学意义(P<0.05)。结论：负载hBMP2基因修饰的β-TCP/胶原支架材料具有良好的生物相容性、优良的骨诱导性和骨传导性，是一种理想的骨缺损修复材料。

BMP；β-TCP/胶原；分化；骨缺损

临床上骨缺损是一种多发、常见而又治疗相当复杂的先天性、发育性及后天性的疾患，不仅会给社会也会带来沉重的经济和医疗负担，同时也导致患者非常严重的形态畸形和功能活动障碍。颌骨缺损修复一直是临床治疗中的难题[1]。伴随着组织工程技术日益发展，支架材料复合成骨生长因子已经成为骨缺损修复一门新兴技术。在种类相当繁多的的支架材料中，β磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)是构成骨组织众多无机物质中的一种，它具有良好的生物相容性，但是不少学者发现β-TCP大多数情况下组织的相容性尚可，但其生物的响应性-即受植区组织对其反应性远远不如自体的骨组织[2]。因此解决此类问题成为国内外学者们潜心钻研论证的课题。实验研究组在掌握了先进技术和提供专业材料的基础上，评估检测并论证具备微一纳孔结构的TCP/胶原复合材料的生物相容性，课题组在预实验阶段已经成功制备了微一纳孔结构的TCP/胶原复合材料。利用该支架材料的胶原成分作为质粒DNA载体进行体外实验研究。从而研制出性能优异的骨缺损组织工程复合支架材料。本实验将研究的主方向定位到新一代的成骨材料上。将具有骨传导性能的支架与具有生物活性能的成骨因子进行复合，形成的复合支架材料以期同时具备骨传导性和骨诱导性。

1 材料和方法

1.1 实验设计与材料分组

实验设计：体外细胞观察性实验研究。

时间及地点：自2015-03～2016-01于佳木斯大学基础实验室完成。

实验材料分组：支架组：含hBMP-2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复 合材料，再分为4小组，每组质粒浓度分别为：Z0：0μg、Z14：14μg、Z29：29μg、Z43:43μg。平皿组：含hBMP-2为目的基因的质粒DNA，分为4小组，每组质粒浓度分别为：M0:0μg、M1:1μg、M2:2μg、M4:4 μg。

主要实验仪器：层流超声工作台(上海博讯实业有限公司，中国)；电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司)、超低温冰箱(Thermo，美国)；电镜日本岛津(SSX-550)倒置显微镜(Olympus BX5，日本)；辅助电动移液枪、离心管、微量移液器( Brand，德国)；高速Megafuge离心机(美国Thermo Scientific)；涡旋离心机(美国Scientific instrument)。

1.2 实验方法

①合成带有hBMP2基因的质粒DNA，②负载hBMP-2为目的基因质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复合材料，③MC3T3-E1细胞培养，④材料与细胞复合培养。

1.3 检测方法与指标

1.3.1 形态学观察：体外细胞样品经过取材、固定、脱水等预先处理后，扫描电镜、光镜进行细胞形态学观察。

1.3.2 碱性磷酸酶活性ALP检测：成骨诱导液由完全培养基中加入地塞米松1×10-8M(sigma,Germany)、β-甘油磷酸钠10mM(sigma,Germany)、维生素C 50μg/mL(华润双鹤药业，中国)配制而成。将平皿与支架上成骨诱导1d、3d、7d、14d的细胞用预冷的PBS洗两遍，胰酶消化后离心去上清，加入100μL 0.1% triton X-100(Amresco,USA)，打散细胞后4℃放置6h，离心取上清。根据碱性磷酸酶测试盒说明书(南京建成，中国)对碱性磷酸酶活性进测定。

1.3.3 茜素红染色检测钙结节：24孔板培养细胞， 成骨诱导14f。0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)溶液配制。取1g Tris 溶于100mL三蒸水，使用 HCL 缓慢滴加与上述溶液中调定pH值于8.3，再加入0.1g茜素红，现用现配。

①吸出培养基后,用PBS清洗3遍。②4%多聚甲醛固定30min。③双蒸水清洗2遍，每孔加入500μL0.5%茜素红染液，避光室温放置1h。④吸出茜素红染液，双蒸水清洗2遍。大体和显微镜下观察钙结节形成情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 形态学观察

支架电镜图：含人BMP2质粒DNA修饰的纳米级β-磷酸三钙/I型胶原复合材料的扫描电镜下观察形态，见图1。显示复合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。

2.2 碱性磷酸酶ALP活性检测

将成骨细胞分别接种在平皿和支架材料的表面，在诱导后的1d、3d、7d、14d对成骨细胞中ALP的活性进行检测，发现在成骨诱导过程中ALP表达呈现升高的趋势，在成骨细胞接种早期(1、3天)，ALP分泌的量很少，在各组间差异不是很显著，从第7天起，接种于支架材料的成骨细胞分泌的ALP开始增加明显且高于平皿组，并且在平皿培养的细胞中转染BMP2可促进ALP的表达，见图2。

图1 扫描电镜下的形态(标尺：100μm)

图2 ALP活性检测

2.3 茜素红染色检测钙结节

小鼠前成骨细胞在成骨诱导第1天，第3天，第7天，第14天后，分别进行茜素红染色，在第一天，第3天对照结果不是很显著，第7天，14d后，茜素红结果显示平皿组可见略有结节突起成微红色，见图3，支架组能明显观察到突起的结节，钙结节着色较平皿组深，呈橘色，数量较多。见图4。

图3 A平皿组茜素红染色 图4 B支架组茜素红染色

2.4 实时荧光定量PCR检测细胞成骨相关基因表达

MC3T3-E1细胞在成骨诱导1d、3d、7d、14d后,支架组Runx2、OCN表达量均明显高于平皿组,其中支架组Runx2、OCN、ALP、OPN 有显著性差异(P<0.05)。图5结果表明,复合支架材料由于掺入了具有生物活性的质粒,在一定时期内提高了成骨细胞的相关基因表达水平。据此,我们推测该类材料的成骨活性主要通过影响和调控成骨基因的表达,从而促进成骨细胞的生长、分化和骨基质形成。

3 讨论

颌骨缺损的治疗一直以来是临床上得热点，近年来骨组织工程的迅速发展为颌骨缺损治疗提供了一条新的途径[3]。以往的骨组织工程研究中，常将矿化物质骨模型、胶原和藻酸盐混合固态多孔的羟磷灰石、壳聚糖、磷酸钙和聚合物作为支架材料来促进颌骨组织再生。但是这些支架材料容易引起动物的免疫原性，可再生数量和保质期受限，且功能不显著，因此很少用于临床研究[4]。

图5 RT-PCR检测

理想的骨缺损的修复材料应具备优良的骨诱导活性[5，6]。hBMP-2可以诱导成骨前体细胞分化为成骨细胞.它不仅对定向性成骨前体细胞有促进分化的作用,还可使可诱导的成骨前体细胞,如人皮肤成纤维细胞及成肌细胞分化为成骨细胞[7]，大量研究已证实BMP-2具有最强的骨诱导能力[8]。因此本实验采用局部基因治疗的方法将编码BMP-2基因的质粒DNA负载到纳米级多孔β-TCP/胶原支架材料植入体内后，支架缓释BMP-2 DNA，转染细胞并持续表达BMP-2。

随着再生医学的迅猛发展以及分子生物学技术在骨再生研究中的广泛应用，研究骨修复材料与成骨细胞及宿主间的相互作用成为当前骨再生医学的研究重点与热点[9]。大量的研究表明高浓缩成骨基因聚合物包裹DNA支架在体内和体外均具有良好的生物学效应[10]。

综上所述，负载BMP2基因修饰的β-TCP/胶原支架材料具有良好的生物相容性、优良的骨诱导性和骨传导性，具有良好的临床应用前景，是一种理想的骨缺损修复材料。可以应用于口腔种植修复、口腔颌面外科及其与口腔正畸联合修复骨缺损治疗中。

[1]刘星纲，翁文剑，邓旭亮，等.纳米 -磷酸三钙/胶原复合体修复兔颌骨缺损的研究[J].口腔医学，2005，(4)：196-198

[2]Hosseinkhani H,Inatsugu Y,Hiraoka Y,et al.Impregnation of plasmid DNA into three-dimensional scaffolds and medium perfusion enhance in vitro DNA expression of mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng，2005，11(9-10):1459-1475

[3]Gugala Z,Davis AR,Fouletier-Dilling CM,et al.Adenovirus BMP2-induced osteogenesis in combination with collagen carriers[J].Biomaterials,2012,28(30):4469-4479

[4]段峰,栗秋,赵刚.人参皂苷Rg1对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化的相关研究[J].黑龙江医药科学,2016,39(1):94-95

[5]Lin CY,Chang YH,Kao CY,et al.Augmented healing of critical-size calvarial defects by baculovirus-engineered MSCs that persistently express growth factors[J].Biomaterials,2012,33(14):3682-3692

[6]Baas E,Kuiper JH,Yang Y,et al.In vitro bone growth responds to local mechanical strain in three-dimensional polymer scaffolds[J].Journal of Biomechanics,2010,43:733-739

[7]Hartman GA，Arnold RM，Mills MP，et al.Clinical and histologic evaluation of anorganic bovine bone collagen with or without a collagen barrier[J].Int J Periodontics Restorative Dent,2004，24(2)：127-135

[8]赵熙儒,赵刚,莫宏兵,等.壳聚糖修饰后的纳米羟基磷灰石作为BMP-2输送载体转染细胞的研究[J].黑龙江医药科学,2012,35(1):3-4

[9]Chen D，Zhao M，Mundy GR.Bone morphogenetic proteins[J].Growth Factors,2004，22(4)：233-241

[10]Crouch AS,Miller D,Luebke KJ,et al.Correlation of anisotropiccell behaviors with topographic aspect ratio [J].Biomaterials,2009,30(8):1560-1567

RUANQiang,ZHAOGang,XIAOYue,SUNJia-ning

(Dental College Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective:To build containing hBMP2(Human Bone morphogenetic proteins2，hBMP2) plasmid DNA β-TCP(β-Tricalcium Phosphate/Collagen β-TCP)/collagen scaffold material,and to study its effect on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells.Methods:The nanoscale porous β-TCP/collagen/collagen scaffold loaded by BMP2 gene plasmid DNA genetic modification of scaffold materials was prepared.MC3T3-E1 cells lines and composite scaffolds in vitro culture system was established.It can be divided into stent group and dish group.According to different concentration of plasmid,each group could be also divided into four groups.The sample cell morphology was selected after compound training by scanning electron microscope and light microscope for further observation.1,3,7,14 days activity detection measurement cells the activity of alkaline Phosph-atase 1,3,7,14 days observe the alizarin red staining.Test results were processed and statistically analyzed.Results：For the purpose gene plasmid DNA containing hBMP2 modified nano beta TCP/solutions of type I collagen composite cells adhesion number,quantity and distribution of material surface is higher than that of pure containing hBMP -2 for the purpose gene plasmid DNA (P<0.05).By using alkaline phosphatase activity of ALP,and Alizarin red staining,the test results show that the stent group of cells of MC3T3 -E1 osteogenesis ability than the influence of the dish group.Conclusion：We conclude that porous β-TCP/collagen scaffold loaded with BMP2 DNA is an appropriate candidate for bone defect repair material .

BMP2；β-TCP/collagen；differentiation；bone defect

1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201487；2.佳木斯大学研究生创新项目，编号：LZR2015_015。

阮蔷(1988～)女，内蒙古包头人，在读硕士研究生。

赵刚(1975～)男，黑龙江依兰人，硕士，硕士研究生导师，副教授。E-mail：13504545575@126.com。

Q254

A

1008-0104(2016)05-0005-03

2016-05-07)The evaluation of β tricalcium phosphate/collagen scaffold modified by human bone morphogenetic proteins 2 plasmid on the differentiation of MC3T3-E1