原癌基因C-met在食管鳞癌中的表达与预后相关性研究①

朱晓峰,张浩业,乔 峰,窦鹏挥,邹志田

(佳木斯大学附属第一医院胸外科，黑龙江 佳木斯 154003)



原癌基因C-met在食管鳞癌中的表达与预后相关性研究①

朱晓峰,张浩业,乔 峰,窦鹏挥,邹志田

(佳木斯大学附属第一医院胸外科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨C-met基因mRNA阳性表达与食管鳞癌复发、转移及预后的相关性。方法：应用RT-PCR技术检测50例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met mRNA的表达情况，统计学分析C-met mRNA表达与临床病理资料、复发转移及预后的相关性。结果：C-met mRNA在食管鳞癌组织中阳性表达率明显高于癌旁正常食管组织(P<0.01)；C-met mRNA阳性表达率与癌组织浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.01)和TNM(P<0.01)分期有关，而与患者年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关；C-met mRNA阳性表达者与阴性表达者在术后5年内发生复发、转移的例数分别为16例(59.3%)和5例(21.7%)，差异有统计学意义(P<0.01)；C-met mRNA阳性表达者的5年生存率为25.9%，明显低于阴性表达者的60.9%(P<0.01)；COX回归多因素分析提示C-met mRNA阳性表达是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素(HR=6.026,P=0.005)。结论：C-met mRNA的检测对判断食管鳞癌的复发、转移及预后有重要临床意义。

食管；鳞状细胞癌；逆转录-聚合酶链反应；C-met基因；预后

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，手术目前是其主要的治疗方法，然而即使临床分期较低的食管癌患者，手术后仍然有20%～30%的复发率，这提示食管癌患者的预后在很大程度上取决于其内在的生物学行为，尤其是基因表达失调对于肿瘤本身的生长、增殖以及侵袭、转移起着至关重要的作用。C-met是一种由C-met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前研究表明[1]，C-met与多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关，许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有C-met的过度表达和基因扩增。当前国内外关于食管鳞癌C-met表达情况的研究报道较少，所以本研究通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了50例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met mRNA的表达，并分析C-met mRNA的表达与临床病理资料之间的关系，判断其与食管鳞癌术后复发、转移及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

50例食管鳞癌手术标本及20例癌旁正常食管组织标本来自于佳木斯大学附属第一医院胸外科2008-11～2010-12手术病例,其中男40例,女10例，年龄35～71岁,中位年龄52.6岁。50例肿瘤组织中,11例低分化,25例中分化,14例高分化,23例有淋巴结转移。肿瘤部位中段24例，下段26例。肿瘤大小≤5cm 28例，>5cm 22例。根据国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的食管癌临床分期标准，Ⅱa期27例，Ⅱb+III期23例，食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手术范围内。胸腹部淋巴结清扫范围参照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)食管癌淋巴结分布图，淋巴结清扫数目8～24枚，平均9.8枚。所有患者术中肉眼大体判断均达RO切除，术后病理诊断食管鳞癌，食管上、下切缘均无肿瘤细胞残留。相应的癌旁正常食管组织标本为术中采集距离食管癌组织至少5cm以上的正常食管组织。所有患者术前未行放疗、化疗等治疗，手术标本取材后马上放入液氮罐中保存。

1.2 主要试剂及药品

总RNA提取试剂盒(Trizo Rragent,Gibcobrl公司),RT-PCR试剂盒(Takara公司),DNA分子量标准(北京中山公司),其它试剂均为国产优质分析纯。

1.3 RT-PCR实验方法和结果判定

按照Trizol的说明书，首先应用Trizol一步法分别提取食管鳞癌和癌旁正常食管组织中的总RNA，然后用紫外分光光度计测定纯度并定量。从总RNA 中取0.5μg 用于合成cDNA第一链。逆转录反应体系中加入以下试剂：MgCl22μL、10×RNA buffer 1μL、Rnase Free dH2O 3.75μL、 dNTP1μL、 Rnase Inhibitor 0.25μL、 Rnase Transcriptase 0.5μL和 Random 9mers 0.5μL样品1μL。逆转录反应条件：30℃ 10min、42℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 10min。根据GenBank提供的C-met和内参照β-actin的mRNA序列，应用Oligo5.0软件自行设计引物。设计引物序列由上海科华生物公司合成。C-met上游引物：5＇-TTCACCGCGGAAACACCCATC -3＇；下游引物：5＇-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT -3＇。预计扩增片段C-met140bp。β-actin上游引物，5＇-GGCATCCTCACCCTGAAGTA -3＇，下游引物，5＇-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC -3＇。预计扩增片段为496 bp。C-met特异性引物稀释终浓度为20pmol/μL，内参照β-actin特异性引物稀释终浓度为10pmol/μL。取2.5μL cDNA用于PCR扩增,在反应体系中加入以下试剂：5×RNA buffer 2.5μL、灭菌 ddH2O 7.16μL、 TaqHs 0.04μL和C-met的上、下游引物各0.15μL或者β-actin的上、下游引物各0.15μL。C-met基因的逆转录扩增反应条件：95℃ 2min变性、95℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min、一共30个循环，最后72℃延伸7min。取2μLPCR产物与2μL Lodding Buffer混合，进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V/1.5h，电泳结束后，凝胶成像仪成像分析，计算目的基因mRNA的相对含量。应用100bp梯度的Makers(中山公司)为分子量大小对照，确定电泳条带。

1.4 随访

对患者定期随访，记录肿瘤复发或转移的时间，死于肿瘤复发或转移的患者纳入生存分析。随访截止日期为2015年12月底，术后中位随访时间为40.7个月(22～62个月)。所有患者都进行随访，随访率100%，随访通过门诊复查及电话进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，两样本率的比较用皮尔逊卡方检验法,Kaplan-Meier寿命表法进行生存分析，Log-rank检验判断生存差异性，采用COX回归多因素分析法判定独立的预后因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织中C-met mRNA及β-actin mRNA的表达

依据C-met mRNA和β-actin mRNA条带灰度值比较分析结果，50例食管鳞癌组织中有27例C-met mRNA阳性表达(阳性率为54.0%)；而20例癌旁正常组织仅有1例C-met mRNA阳性表达(阳性率为5.0%)。50例食管鳞癌组织和20例癌旁正常组织均有β-actin mRNA表达，见图1。

1：食管鳞癌组织；2：癌旁正常食管组织；M：DNA分子量标准基因产物：C-met mRNA 140bp，β-actin mRNA 496bp

2.2 C-met mRNA表达情况与临床病理资料的关系

在食管鳞癌组织中，C-met的表达与患者年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关，而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关，见表1。

表1 C-met mRNA在食管鳞癌中的表达与临床病理资料的关系

2.3 C-met mRNA表达情况与食管鳞癌术后复发、转移的相关性

术后随访出现复发、转移的患者共21例，复发转移率为42.0%。C-met mRNA阳性表达者有复发、转移的为16例(59.3%)，阴性表达者中为5例(21.7%)，二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 C-met mRNA表达情况与食管鳞癌预后的相关性

应用Kaplan-Meier生存曲线对50例患者进行术后随访，结果显示所有患者的5年生存率为42.0%。C-met mRNA阳性表达者5年生存率为25.9%，C-met mRNA阴性表达者5年生存率为60.9%，log-rank检验显示二者差异具有统计学意义(P<0.01)。COX回归多因素分析显示淋巴结转移(HR=4.896,P=0.008)和C-met mRNA表达(HR=6.026,P=0.005)是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素。

3 讨论

C-met基因位于人类第七号染色体长臂(7q31)，大小约超过110kbp，包含21个外显子。它的启动子区域包含许多的调控序列，有AP1、AP2、NF-KB和HGF基因等。C-met基因编码蛋白产物是先合成170kD的单链前体物，进而切割和重排成50kD的α亚基和145kD的β亚基，然后两亚基再以二硫键相连形成190kD的异二聚体。α亚基和β亚基的胞外区是配体识别部位，可识别并结合HGF，而胞内部位具有酪氨酸激酶活性，是多种信号分子相互作用的结合部位。作为肝细胞生长因子(HGF)唯一受体蛋白，C-met受体被HGF激活后发生自体磷酸化，其酪氨酸激酶活性增强，导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化，这些中间底物的激活扩大了HGF的生物学活性，如促进细胞增殖、运动等[2]。

目前认为C-met促进肿瘤进展的机制主要有以下几点：①C-met通过上调环氧合酶COX-2的基因表达和增加前列腺素(PG)的合成，从而促进食管癌的发展和转移[3]。②C-met诱导基质降解酶的产生，通过破坏基底膜和增加蛋白水解来促进肿瘤的侵袭和转移[4]。③在食管恶性肿瘤的生长和增殖过程中新生血管的形成是不可或缺的[5]，同时也是肿瘤侵袭转移的必要条件，而HGF是一种促血管生长因子，它与内皮细胞表达的C-met受体特异性结合，能够激活血管内皮细胞，引起血管内皮细胞的增殖和迁移，从而参与肿瘤新生血管的形成[6]。

最近的研究表明在正常细胞中C-met的表达和在肿瘤细胞中有着明显的区别。在正常细胞中，原癌基因C-met mRNA呈低表达或不表达，虽然在组织器官切除或损伤后，C-met的表达有一过性的增加，但表达水平很快恢复到正常，证明正常细胞可以通过减少C-met的表达来控制它对HGF的反应。在许多恶性肿瘤细胞中，可以观察到C-met的持续、过度表达，常常伴随高水平的自体磷酸化，这通常是由于基因的扩增所致。C-met的过度表达可见于人的肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、结肠癌和脑胶质瘤，C-met的过度表达提示肿瘤预后差[7，8]。

本研究利用RT-PCR技术，以β-actin为内参照，检测了食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织中C-met mRNA的表达情况，结果提示C-met mRNA在癌旁正常食管组织中低表达，而在食管鳞癌组织中呈高表达(P<0.01)。本实验的研究结果还发现，C-met mRNA的表达与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关，浸润深度越深C-met mRNA阳性表达率越高(P<0.05)，有淋巴结转移患者C-met mRNA阳性表达率显著高于无淋巴结转移患者(P<0.01)，表明C-met mRNA基因的表达与癌组织浸润深度、淋巴结转移呈正相关，而与患者年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关(P>0.05)，更进一步说明食管鳞癌中C-met的过度表达能促进肿瘤细胞的扩散和转移，提示C-met的过度表达与食管鳞癌的不良病理参数密切相关，肿瘤预后差。

本研究还发现，C-met mRNA阳性表达者复发、转移率为59.3%，明显高于阴性表达者的21.7%。50例食管鳞癌患者总的5年生存率为42.0%，C-met mRNA阳性表达患者的5年生存率为25.9%，明显低于阴性表达患者的60.9%。COX回归多因素分析显示，淋巴结转移和C-met mRNA表达是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素。

目前以HGF-C-met信号通路为靶点的抑制剂、拮抗剂和反义核苷酸治疗在多项实验研究中已经取得了可喜的成果。许多能够阻断HGF-C-met信号转呈途径的化合物已经被发现，其中的典型代表是格尔德霉素类药物(GA)。由于GA能降低C-met受体的表达，而且具有降低HGF诱导的uPA的表达的作用，因此在抑制肿瘤转移方面有很大临床意义。HGF拮抗剂NK4由HGFɑ链N末端的发夹样结构和4个Kringle区结构所组成，能够和C-met相结合，竞争性地抑制HGF和C-met的相互作用，影响HGF-C-met信号通路，进而抑制HGF诱导的肿瘤细胞侵袭转移过程。多项体外实验显示NK4可抑制HGF诱导的包括人结肠癌、胆囊癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管癌和前列腺癌等细胞的运动和侵袭。有国内学者采用脂质体法合成的C-met反义寡核苷酸链,将构建的C-met反义质粒及U1SnRNA/核酸/反义C-met复合体分别转染肝癌SF7721细胞，来封闭C-met信号转呈，探讨C-met信号转呈阻滞对肝癌生长和转移的影响。结果显示C-met反义寡核苷酸链能抑制肝癌SF7721细胞的增殖，C-met反义质粒及U1SnRNA/核酸/反义C-met复合体质粒转染后细胞表达受体C-met的量均显著减少，而且转染后细胞增殖速度明显减慢，侵袭运动能力减弱。体内实验也发现细胞转染后裸鼠体内生成肿瘤速度较慢，进而证明阻断HGF-C-met的信号传导能够降低肿瘤生长甚至转移的能力。国外学者也应用C-met反义寡核苷酸/U6表达质粒治疗非小细胞肺癌，同样观察到伴有C-met蛋白表达下调的对肿瘤的抑制作用[9，10]。

C-met基因在食管鳞癌中表达的研究较少,它在食管鳞癌发生、发展中的作用机制尚不完全清楚,但是C-met mRNA在食管鳞癌中呈现高表达而且与肿瘤侵袭、复发及转移密切相关，所以研究其结构、功能和作用机制对判断食管鳞癌的复发、转移、预后及以后的治疗有重要临床意义，HGF-C-met信号通路有望成为未来生物治疗的靶点。

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黑龙江省卫生厅科研项目,编号：2012-187。

朱晓峰(1970～)男，黑龙江佳木斯人，博士，主任医师，硕士研究生导师。

邹志田(1962～)男，黑龙江佳木斯人，博士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:zxf700105@sina.com。

R735.1

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1008-0104(2016)05-0001-04

2016-04-09)