亚硝酸钠对雄性小鼠的损伤及修复机制研究

张　旺，申元英，陈红云，宋正蕊，季守莲，王金勇

（大理大学公共卫生学院，云南大理671000）

亚硝酸钠对雄性小鼠的损伤及修复机制研究

张旺，申元英，陈红云，宋正蕊，季守莲，王金勇*

（大理大学公共卫生学院，云南大理671000）

目的：研究NaNO2对雄性小鼠的损伤及修复机制。方法：昆明种雄性小鼠，剂量组经口给予NaNO2（15、30、60 mg/（kg·d）），对照组给予等体积生理盐水，连续14 d，末次染毒24 h后，处死各剂量组1/3小鼠，余下小鼠分两组，给予NaNO2等剂量枸杞多糖和等体积生理盐水，连续14 d，处死全部实验动物。测定主要脏器、睾丸及附睾的重量、脏器系数，血清睾酮水平和精子畸形率。结果：随NaNO2剂量增加，睾酮水平、脾脏重量均下降（P＜0.05），精子畸形率升高（P＜0.05）；停止给予NaNO2后，在15、30 mg/kg NaNO2组，精子畸形率下降，睾酮水平升高及脾脏器系数，与之前比较差异具有统计学意义（P＜0.05），其他指标差异无统计学意义。结论：NaNO2具有抑制小鼠睾酮水平、诱导精子畸变的能力；停止染毒后，小鼠自身具有一定修复能力，枸杞多糖也可能具有一定的修复作用，但还有待进一步研究。

NaNO2；脏器系数；睾酮激素水平；精子畸形

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.009

枸杞是我国传统的名贵中药，很多学者研究它对雄性生殖系统的作用，有实验证实枸杞具有保护雄性生殖系统的作用〔1〕。研究发现，作为肉类制品常用的发色剂和防腐剂的亚硝酸盐〔2〕，其广泛过量地使用已严重影响人类的健康，尤其是对人类生育力的影响〔3〕。以往对亚硝酸盐生殖毒性的研究多采用单阶段动物实验，结果呈现以毒性损害为主，对其损害的修复机制研究较少。本次实验研究采用分段式动物实验，一方面进一步明确亚硝酸盐对各脏器的毒性损害，另一方面观察枸杞多糖是否具有修复生殖系统损害的功效。

1　材料与方法

1.1实验动物选择成年昆明种雄性小鼠44只，体重20～30 g，普通级，由大理大学实验动物中心提供（合格证号∶SYXK（滇）2008-0003）。

1.2主要试剂和仪器亚硝酸钠（NaNO2，分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；枸杞多糖（纯度70%，生产批号∶YSCI 20130804，西安源森生物科技有限公司）；甲醇（分析纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司）；2%伊红、睾酮（P）试剂盒（上海一基实业有限公司）；酶标仪、光学显微镜。

1.3实验分段及给药

1.3.1第一阶段将实验动物随机分为4组，其中，3个实验组，1个对照组，每个实验组12只，对照组8只，实验组分别给予NaNO215、30、60 mg/（kg·d），灌胃0.1 mL/10g，对照组给予等体积生理盐水，连续14 d，末次染毒24 h后，各实验组处死4只实验动物，进行相关指标检测。

1.3.2第二阶段第一阶段结束后，对照组小鼠继续给予生理盐水，各实验组小鼠再随机分为A、B组（每组4只）。A组按10 mg/（kg·d）的枸杞多糖溶液灌胃，B组小鼠给予相同剂量的生理盐水，灌胃0.1 mL/10g，连续14 d，末次染毒24 h后，处死所有实验小鼠并分析相关指标。

1.4样品采集及处理

1.4.1脏器系数的测定各阶段末次染毒24 h后称重，断头处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾、睾丸和附睾并称重。并换算脏器系数，进行分析。

1.4.2血清激素测定各阶段末次染毒24 h后，断头取血，采用ELISA法测定血清睾酮水平。

1.4.3小鼠精子畸形率测定各阶段末次染毒24 h后，取双侧附睾，计数精子畸形率。

2　结果

2.1NaNO2对雄性小鼠主要脏器及生殖系统的影响NaNO2对雄鼠主要脏器系数、睾酮水平和精子畸形率的影响∶脾脏系数、激素水平随着NaNO2染毒剂量的增加而降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；畸形精子的类型以无钩、香蕉头、胖头和不定形为主，随染毒剂量增加，精子畸形率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义。见表1。

表1　NaNO2对雄鼠主要脏器系数、睾酮水平和精子畸形率的影响

表1　NaNO2对雄鼠主要脏器系数、睾酮水平和精子畸形率的影响

注：*表示差异有统计学意义，P＜0.05。

分组剂量/（mg/kg）心脏/（mg/g）肝脏/（mg/g）脾脏/（mg/g）肺/（mg/g）肾脏/（mg/g）睾丸和附睾/（mg/g）睾酮/（nmol/L）精子畸形率/%对照组0 5.99±0.15 55.47±8.64 9.83±0.69 10.84±2.50 13.67±3.56 9.84±0.41 134.14±20.92 7.61±0.35低剂量组15 5.36±0.30 54.43±9.56 9.01±0.91 9.86±2.52 13.93±2.43 8.60±2.54 116.21±19.42 11.00±1.20中剂量组30 6.24±0.64 60.05±5.25 8.67±0.38 19.05±11.66 13.87±2.40 11.62±4.01 100.30±9.49 14.56±1.71高剂量组60 5.61±0.76 58.17±15.07 7.40±0.48 13.22±3.95 14.47±0.84 8.82±1.00 92.72±8.60 15.75±1.06 F—1.673 0.186 7.299 1.243 0.057 0.960 4.132 29.789 P—0.249 0.903 0.011*0.356 0.981 0.457 0.048*＜0.05*

2.2枸杞多糖、机体自身对NaNO2损伤的修复作用对15 mg/kg NaNO2组进行第一阶段（NaNO2染毒阶段）与第二阶段A（给予枸杞多糖阶段）和第二阶段B（给予生理盐水阶段）的指标比较，得到以下结果∶染毒期的精子畸形率、睾酮水平和脾脏器系数与恢复期A、B两组差异均有统计学意义（P＜0.05）；其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　15 mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

表2　15 mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

注：△表示第一阶段与第二阶段A之间差异有统计学意义，☆表示第一阶段与第二阶段B之间差异有统计学意义，*表示P＜0.05，差异具有统计学意义。

分组脾脏/（mg/g）睾酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一阶段9.01±0.91△，☆116.21±19.42△，☆11.00±1.20△，☆第二阶段A 4.14±1.75 206.13±20.99 6.96±0.71第二阶段B 6.00±0.57 194.80±24.39 7.19±0.27 F 13.811 16.317 29.221 P 0.003*0.002*＜0.000 1*

对30 mg/kg NaNO2组进行第一阶段（NaNO2染毒阶段）与第二阶段A（给予枸杞多糖阶段）和第二阶段B（给予生理盐水阶段）的指标比较，得到以下结果∶染毒期的精子畸形率、睾酮水平和脾脏器系数与恢复期A、B两组差异均有统计学意义（P＜0.05）；其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　30mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

表3　30mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

注：△表示第一阶段与第二阶段A之间差异有统计学意义，☆表示第一阶段与第二阶段B之间差异有统计学意义，*表示P＜0.05，差异具有统计学意义。

分组脾脏/（mg/g）睾酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一阶段8.67±0.38△，☆100.30±9.49△，☆14.56±1.71△，☆第二阶段A 5.19±1.07 202.80±33.68 7.99±1.97第二阶段B 4.41±2.02 187.91±16.76 7.99±1.04 F 9.301 16.699 16.152 P 0.011*0.002*0.002*

对60 mg/kg NaNO2组进行第一阶段（NaNO2染毒阶段）与第二阶段A（给予枸杞多糖阶段）和第二阶段B（给予生理盐水阶段）的指标比较，得到以下结果∶染毒期的精子畸形率与恢复期A、B两组差异均有统计学意义（P＜0.05）；其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4　60mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

表4　60mg/kg NaNO2组前后两阶段的指标比较

注：△表示第一阶段与第二阶段A之间差异有统计学意义，☆表示第一阶段与第二阶段B之间差异有统计学意义，*表示P＜0.05，差异具有统计学意义。

分组脾脏/（mg/g）睾酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一阶段7.40±0.48 92.72±8.60 15.75±1.06△，☆第二阶段A 5.01±2.68 204.63±42.31 8.00±1.47第二阶段B 6.14±1.83 267.02±167.97 8.05±2.58 F 0.878 1.844 13.323 P 0.463 0.237 0.006*

3　讨论

第一阶段实验结果∶随着NaNO2的剂量增加，雄性小鼠的脾脏器系数随之下降，表明NaNO2对小鼠脾脏有损伤，且为持续性的损伤，继而影响小鼠的免疫功能，这与郝恩柱等〔4〕的研究结果一致。第二阶段实验结果∶①比较枸杞多糖对NaNO2损伤的修复，从表2～4均可见枸杞多糖组睾酮水平高于NaNO2组，枸杞多糖组精子畸形率低于NaNO2组，两指标在两组间的差异均有统计学意义，这说明枸杞多糖具有保护睾丸组织的作用，与TAN Q H等〔5〕的研究结果一致，但是，从表2～4中还发现，枸杞多糖组的脾脏器系数均小于NaNO2组，枸杞多糖是用来对NaNO2的损害进行修复的，在NaNO2染毒结束后，持续2周，得到这样的结果说明NaNO2对小鼠脾脏的损害是持续性的，且实验中的枸杞多糖剂量是无法有效对脾脏损害进行修复的，这提示后续的实验剂量设计应加大剂量，才可判断是否存在修复作用。②比较生理盐水对NaNO2损伤的修复，从表2～4均可见生理盐水组睾酮水平高于NaNO2组，生理盐水组精子畸形率低于NaNO2组，两指标在两组间的差异均有统计学意义，这说明停止给予NaNO2后，机体具有一定的自身修复功能，也即反应了睾丸组织具有较强的自身修复能力。对于表中，生理盐水组的脾脏器系数均小于NaNO2组，验证了前面提到的NaNO2对脾脏的损害是持续的，且在2周内是无法进行有效自身修复的。③比较枸杞多糖和生理盐水的修复效果，从表2～4可见，二者的修复效果无统计学差异，这与MA〔6〕、许忠新等〔7〕的结果存在一定的差异，分析其原因可能是实验中所使用的枸杞多糖是市售的，纯度较低，仅为70%，导致枸杞多糖有效剂量过低。枸杞多糖是否对亚硝酸盐所致生殖系统的损害具有修复功效，尚需进一步确认。

〔1〕罗琼，黄晓兰，李卓能，等.枸杞多糖对雄性大鼠性功能及生殖功能的影响〔J〕.营养学报，2006，28（1）：62-65.

〔2〕赵颖，臧明伍，冯伟，等.模拟腌肉制品体系中亚硝酸钠残留量预测模型的建立〔J〕.中国食品添加剂，2014（3）：130-138.

〔3〕何杰明，王丽丽，王尚明，等.亚硝酸钠短期暴露对雄性小鼠生殖的影响〔J〕.中国计划生育学杂志，2015，23（3）：165-168.

〔4〕郝恩柱，高永.亚硝酸钠对小鼠免疫功能的影响〔J〕.中国公共卫生学报，1995，14（3）：192.

〔5〕TAN Q H，AN C X，XIAO Y，et al.Protective effect of lycium barbarum polysaccharides against heat stress-induced germ cell apoptosis in rats and its mechanism〔J〕.National journal of andrology，2012，18（1）：88-92.

〔6〕MA L H，QIU Z J，YAN S N，et al.Influence of lycium barbarum polysaccharides on proliferation of spermatogonial stem cells in vitro〔J〕.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，15（23）：4277-4281.

〔7〕许忠新，单铁英，苏安英，等.枸杞多糖对人外周血巨噬细胞活性的影响〔J〕.重庆医学，2010，39（16）：2177-2178.

Study on the Sodium Nitrite Injury and Repair Mechanisms to the Male Mice

Zhang Wang，Shen Yuanying，Chen Hongyun，Song Zhengrui，Ji Shoulian，Wang Jinyong*
（College of Public Health，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the sodium nitrite injury and repair mechanisms to the male mice.Methods:Kunming species male mice were used in the experiment.Dose groups were administered by oral with NaNO2（15，30，60 mg/（kg·d）），while the control groups had been given normal saline of the same volume for 14 days.After 24 hours of the last exposure to NaNO2，one-third of mice in three dose groups were killed.The remaining mice were divided into two groups.One group was given Lyceum barbarum polysaccharide，while another group was given normal saline of the same volume for 14 days and then killed all the mice.Experiment measured index included the main organ weight，organ coefficient，serum testosterone level and sperm deformity rate.Results:With the increasing dose of NaNO2，the mice serum testosterone level and the spleen weight were decreased significantly（all P value＜0.05），the sperm deformity rate was increased significantly（all P value＜0.05）.After stopping giving NaNO2，the level of serum testosterone were increased，the sperm deformity rate and spleen organ coefficient were declined in 15，30 mg/（kg·d）NaNO2groups，the three indexes were statistically significant comparing with previous experiments（all P value＜0.05）.The other indexes had no change.Conclusion:NaNO2had the ability to inhibit the level of serum testosterone and induce the sperm deformity in mice.After stopping exposing to NaNO2，the mice can repair some damages by themselves，the Lyceum barbarum polysaccharide may also have recovery effect，which needs further study.

NaNO2；organ coefficient；hormone level；sperm deformity

R285

A

2096-2266（2016）10-0035-04

（责任编辑李杨）

大理大学开放实验室基金资助项目（2014-79）；大理大学大学生科研基金资助项目（KYSX2013013）

2015-11-18

2016-05-19

张旺，2010级卫生检验专业本科生.

*通信作者：王金勇，副教授.