UPLC-MS/MS法测定人血浆中伏立康唑的浓度及其临床应用Δ

2016-11-18裴泽军无锡市第二人民医院南京医科大学附属无锡第二医院药剂科江苏无锡1400中国药科大学药物代谢动力学重点实验室南京10009

中国药房 2016年29期

钟　皎，郝　琨，裴泽军（1.无锡市第二人民医院/南京医科大学附属无锡第二医院药剂科，江苏无锡1400；.中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京　10009）

·临床药学与研究·

钟皎1＊，郝琨2，裴泽军1#（1.无锡市第二人民医院/南京医科大学附属无锡第二医院药剂科，江苏无锡214002；2.中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京210009）

目的：建立测定人血浆中伏立康唑浓度的方法，并应用于临床。方法：采用超高效液相色谱-串联质谱法测定。以酮康唑为内标，色谱柱为Shim-pack VP-ODS，流动相为水（含1‰甲酸及2 mmol/L乙酸铵）-乙腈，梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，柱温为40℃；采用电喷雾离子源，以多反应监测方式进行正离子扫描，用于定量分析的离子对分别为m/z 351.2→282.2（伏立康唑）、m/z 532.1→490.2（内标）。结果：伏立康唑血药浓度在1～10 000 ng/ml范围内线性关系良好（r＝0.999 5，n＝5），定量下限为1 ng/ml；日内、日间RSD＜10%；方法回收率＞90%（RSD＜8%），提取回收率＞70%（RSD＜8%）。采用该法检测10例深部真菌感染患者体内伏立康唑的血药浓度为507.33～7 011.24 ng/ml，有3例患者的血药浓度不在推荐治疗浓度范围内。结论：该方法快速、准确、灵敏度高，适用于伏立康唑治疗药物监测。

伏立康唑；超高效液相色谱-串联质谱法；血药浓度；治疗药物监测；侵袭性真菌感染

伏立康唑为新型三唑类抗真菌药物，是治疗侵袭性真菌感染的常见药物之一[1-2]。但由于其潜在的药物相互作用和代谢酶细胞色素P450（CYP）2C19的基因多态性，导致其个体间的药动学差异较大[3-4]，有可能引发严重的药品不良反应（ADR），甚至有的ADR是不可逆的[5-7]。有研究表明，伏立康唑的血药浓度与临床疗效、ADR的关系密切[8]。因此，建议对使用伏立康唑的患者进行血药浓度监测。目前，测定伏立康唑的方法多为高效液相色谱（HPLC）法和液质联用（LC-MS）法[9-11]。为进一步提高检测效率，增强实用性、灵敏度和专属性，本试验建立了测定人血浆中伏立康唑浓度的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法，以便更准确、快捷地向临床提供血药浓度监测结果，为临床安全、合理用药提供参考。

1　材料

1.1仪器

AB Sciex 5500型超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（美国AB Sciex公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；AB-256-S型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Sorvall Stratos型台式高速冷冻离心机（美国热电公司）。

1.2药品与试剂

注射用伏立康唑（美国Pfizer Limited公司，注册证号：H2014073，批号：Z327401，规格：200 mg）；伏立康唑对照品（批号：100862-200701，纯度：100%）、酮康唑对照品（内标，批号：100294-200602，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱醇，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。空白血浆由我院检验科提供。

2　方法与结果

2.1色谱与质谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相：水（A相，含1‰甲酸及2 mmol/L乙酸铵）-乙腈（B相），梯度洗脱（0～2.5 min，10%→75%B；＞2.5～4.0 min，75%→98%B；＞4.0～5.5 min，98%B；＞5.5～6.0 min，98%→10%B；维持平衡2 min后，进下一针）；流速：0.3 ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl。

采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测（MRM）模式扫描，正离子方式检测；喷雾电压：4 500 V；温度：350℃；辅助气1（N2）压力：13Arb；辅助气2（N2）压力：19Arb；气帘气（N2）压力：20Arb；用于定量分析的离子对分别为m/z 351.2→282.2[伏立康唑，去簇电压（DP）：150 eV，碰撞能量（CE）：23 eV）]，m/z 532.1→490.2（内标，DP：100eV，CE：43eV）。

2.2溶液的制备

精密称取伏立康唑对照品10 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度为1 mg/ml的伏立康唑贮备液，置4℃冰箱中保存，备用。取伏立康唑贮备液适量，用甲醇稀释制成所需质量浓度的伏立康唑标准溶液。

精密称取内标对照品1 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度为10µg/ml的内标溶液，置4℃冰箱中保存，备用。

2.3血浆样品处理

取空白血浆100µl，加入内标溶液（质量浓度为10µg/ml）10µl，涡旋10 s；加入乙醚1 ml，涡旋5 min，以离心半径为8 cm、转速为10 000 r/min离心5 min，取上清液800µl，于37℃水浴中挥干。残渣用甲醇100µl复溶，再以离心半径为8 cm、转速为18000r/min离心5min，取上清液5µl进样分析。

2.4方法学考察[12]

2.4.1专属性考察在“2.1”项条件下，取空白血浆、空白血浆+伏立康唑+内标、患者用药后的血浆样品+内标，按“2.3”项下方法处理后，进样分析，考察方法的专属性。结果显示，伏立康唑和内标的色谱峰峰形良好，其保留时间分别为5.08、4.38 min，血浆中的内源性物质不干扰待测物和内标的测定，表明该方法专属性良好。其典型色谱图见图1。

图1　典型色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+伏立康唑+内标；C.患者用药后的血浆样品+内标；1.伏立康唑；2.内标Fig 1　Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+voriconazole+internal standard；C. plasma samples of patient after administration+internal standard；1. voriconazole；2.internal standard

2.4.2标准曲线的制备与定量下限的考察取空白血浆、相应质量浓度的伏立康唑标准溶液各适量，分别配制成质量浓度为1、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng/ml的血浆样品，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，记录色谱图。以样品峰面积与内标峰面积的比值（y）为纵坐标、待测物质量浓度（x）为横坐标，用加权最小二乘法（权重系数w＝1/x2）进行线性回归，得回归方程为y＝0.964 1x+0.022 6（r＝0.999 5，n＝5）。结果表明，伏立康唑的血药浓度在1～10 000 ng/ml范围内线性关系良好，其定量下限为1ng/ml[信噪比（S/N）＝10）]。

2.4.3精密度与回收率试验取空白血浆、相应质量浓度的伏立康唑标准溶液各适量，分别配制定量下限浓度（1 ng/ml）血浆样品和低、中、高质量浓度（3、500、7 500 ng/ml，下同）的质控样品，按“2.3”项下方法处理后，进样分析。每质量浓度取5样本分析，连续测定5 d，根据当日标准曲线计算各样品的测得质量浓度，考察方法的日内、日间精密度。以测得质量浓度与加入质量浓度的比值来考察样品的方法回收率，以经提取所得血浆样品的色谱峰面积与未经提取所得的色谱峰面积的比值来考察样品的提取回收率。结果显示，日内、日间RSD均＜10%，各样品的方法回收率＞90%（RSD＜8%），提取回收率＞70%（RSD＜8%）。精密度与回收率试验结果见表1。

表1　精密度与回收率试验结果（±s，n＝5）Tab 1　Results of accuracy and recovery tests（±s，n＝5）

加入质量浓度，ng/ml 0 001 0 003 0 500 7 500日间精密度测得质量浓度，ng/ml 0.91±0.085 3.23±0.21 522.17±48.42 7 718.59±590.14 RSD，% 8.71 6.04 9.16 6.54日内精密度测得质量浓度，ng/ml 0.95±0.079 3.35±0.37 517.67±31.02 7 302.41±472.97 RSD，% 8.12 7.43 6.94 5.11方法回收率，%计算值95.24±7.01 92.78±8.23 107.75±6.57 102.57±3.14 RSD 7.41 7.79 6.39 2.91提取回收率，%计算值71.18±5.97 75.21±6.06 73.90±4.10 76.22±3.04 RSD 6.09 7.58 5.24 3.82

2.4.4基质效应取空白血浆90 μl，按“2.3”项下方法处理后，加入相应质量浓度的伏立康唑标准溶液和内标溶液各适量，配制成定量下限浓度血浆样品和低、中、高质量浓度质控样品，每质量浓度取6样本分析，得相应峰面积（A）；取相应质量浓度的伏立康唑标准溶液与内标溶液的混合溶液直接进样，得相应峰面积（B），基质效应＝A/B×100%。结果显示，定量下限浓度血浆样品和低、中、高质量浓度质控样品的基质效应分别为（97.23±2.55）%、（101.69±3.01）%、（99.84± 1.69）%和（103.77±2.17）%，RSD＜2.82%，表明该方法不受基质效应的影响。

2.4.5稳定性取空白血浆、相应质量浓度的伏立康唑标准溶液各适量，配制定量下限浓度的血浆样品和低、中、高质量的浓度质控样品，分别考察其在室温放置24 h、经历反复冻融3次、－70℃冷冻保存30 d等条件下的稳定性，每质量浓度取5样本进行分析。结果显示，各样品在上述条件下均稳定，RSD＜10%。稳定性试验结果见表2。

2.5临床应用

选择拟采用伏立康唑治疗的深部真菌感染患者10例，按如下给药方法进行治疗：首日予注射用伏立康唑400 mg，ivgtt，bid；于第2天起予注射用伏立康唑200 mg，ivgtt，bid。连续给药3 d后，于下次给药前1 h抽取各患者外周静脉血4 ml，至肝素钠抗凝管中，以离心半径为8 cm、转速为5 000 r/min离心5 min，取上清液，按“2.3”项下方法处理后，进样测定。得患者体内伏立康唑的血药浓度为507.33～7 011.24 ng/ml。10例患者的临床资料和伏立康唑血药浓度检测结果见表3。

表2　稳定性试验结果（±s，n＝5）Tab 2　Results of stability tests（±s，n＝5）

加入质量浓度，ng/ml 0 001 0 003 0 500室温放置24 h测得质量浓度，ng/ml 0.93±0.04 3.26±0.19 531.84±30.74 RSD，% 4.12 5.41 5.09经历反复冻融3次测得质量浓度，ng/ml 0.90±0.07 3.29±0.26 527.17±24.69 RSD，% 7.24 6.67 4.58－70℃冷冻保存30 d测得质量浓度，ng/ml 0.91±0.09 3.31±0.27 530.47±26.32 RSD，% 9.01 7.22 4.92

表3　患者的临床资料和伏立康唑血药浓度检测结果Tab 3　Patients’clinical data and results of plasma concentration determination of voriconazole

3　讨论

在流动相洗脱方式筛选的过程中，为进一步节省分析时间，本课题组采用了梯度洗脱的方式，同时在水相中添加了甲酸，以有利于正离子的质子化，维持样品在流动相中的电离状态，使峰形得以改善。在内标化合物的选择中，笔者筛选了氟康唑、尼群地平和酮康唑等化合物，综合考虑保留时间、响应值、杂质干扰等因素，最终选择酮康唑作为内标。笔者曾考虑采用直接沉淀蛋白法和固相萃取法处理血浆样品，前者常用的沉淀试剂包括高氯酸、三氟乙酸和乙腈等，但提取回收率较低，可能与其可氧化破坏伏立康唑和内标的结构有关，而后者操作烦琐且会增加检测的成本。故综合比较，最终选择了以乙醚作为萃取溶剂的液-液萃取法，此法操作简便，且可获得满意的提取效果。

关于伏立康唑血药浓度测定方法，文献报道较多的是HPLC法[9-10]。但对于深部真菌感染的患者而言，其病情较为危重，且联合用药较多，采用常规的HPLC法常会受到联合用药的干扰，定量下限只能达到50 ng/ml左右，且分析时间较长，其准确性、灵敏度和检测效率不甚理想。Cheng Y等[11]采用分子排阻和柱切换分离技术的液质联用（LC-MS）法，但其成本高且操作烦琐，难以在临床上推广使用。为改进上述检测方法，本试验建立了UPLC-MS/MS法，通过UPLC来提升分析速度，将样本的分析时间由原来的＞10 min缩短至6 min，同时，串联质谱又较一级质谱能更精准地检测待测物。因此，本试验所建立的方法快速、简单、灵敏度高、专属性强，能为临床提供可靠的测定结果，可满足临床治疗药物监测的需求。

据文献[13-15]报道，伏立康唑的肝毒性、横纹肌溶解等ADR与其血药浓度呈正相关，个体差异和药物相互作用等因素会导致血药浓度偏高（产生毒性）或血药浓度过低（低于有效治疗浓度而导致治疗失败），因此临床有必要对伏立康唑的血药浓度进行监测。参考伏立康唑的药动学特征，首日静脉给予伏立康唑负荷剂量400 mg，bid，1～2 d后血药浓度即可达稳态[16]，故将患者的采血时间定于用药3 d后，以确保患者体内的伏立康唑血药浓度已达稳态。目前，推荐的伏立康唑有效治疗浓度范围为1.0～5.5µg/ml[8]，而本研究中10例患者血药浓度的监测结果显示，有3例患者的血药浓度不在此范围内（其中，2例偏高，1例偏低），医师可根据血药浓度监测结果调整给药剂量，确保患者得到有效治疗，为临床合理使用伏立康唑提供依据。

本试验以乙醚为萃取溶剂对血浆样品进行处理，以酮康唑为内标，建立了测定人血浆中伏立康唑浓度的UPLC-MS/MS法，该方法具有快速、准确和灵敏度高等特点，可用于伏立康唑治疗药物监测。

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（编辑：张元媛）

Concentration Determination of Voriconazole in Human Plasma by UPLC-MS/MS and Its ClinicalApplication

ZHONG Jiao1，HAO Kun2，PEI Zejun1（1.Dept.of Pharmacy，Wuxi Second People’s Hospital/Wuxi Second Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Jiangsu Wuxi 214002 China；2.Key Lab of Drug Metabolism and Pharmacokinetics，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To develop a method for concentration determination of voriconazole in human plasma and apply it in the clinic.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.Using ketoconazole as internal standard，the determination was performed on Shim-pack VP-ODS column with mobile phase consisted of water（containing 1‰formic acid and 2 mmol/L ammonium acetate）-acetonitrile（gradient elution）at flow rate of 0.3 ml/min and column temperature of 40℃.The electrospray ion source，positive ionizing pattern and multiple reaction monitoring were used；the mass transition ion-pairs of voriconazole and internal standard were m/z 351.2→282.2 and m/z 532.1→490.2.RESULTS：The linear range of voriconazole were 1-10 000 ng/ml（r＝0.999 5，n＝5），and the limit of quantitation was 1 ng/ml；RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%；method recovery was higher than 90%（RSD＜8%），and extraction recovery was higher than 70%（RSD＜8%）.The plasma concentrations of voriconazole in 10 patients with invasive fungal infection determined by this method were 507.33-7 011.24 ng/ml，and those of 3 patients were outside the recommended treatment concentration range.CONCLUSIONS：The established method is fast，accurate and sensitive，and can be applied for the therapeutic drug monitoring of voriconazole.

Voriconazole；UPLC-MS/MS；Plasma concentration；Therapeutic drug monitoring；Invasive fungal infection

R917

1001-0408（2016）29-4064-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.29.09

无锡市医院管理中心医学科研药学项目（No.YGZXY1301）

＊副主任药师，硕士。研究方向：医院药学。电话：0510-68563496。E-mail：zhong112@126.com

主任药师。研究方向：医院药学。电话：0510-68563360。E-mail：pei-zj@126.com

（2015-11-03

2016-02-02）