HPLC法测定复方鹅绒藤中两种黄酮的含量

王增尚 李 强 盛芳婷 扎西白珍 刘江云* 陈 虹

1.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123；2.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000



HPLC法测定复方鹅绒藤中两种黄酮的含量

王增尚1李 强2盛芳婷1扎西白珍1刘江云1*陈 虹2

1.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123；2.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000

目的：建立同时测定复方鹅绒藤中小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，CosmosilC18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm，5μm) 色谱柱，乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相梯度洗脱，检测波长330nm，流速1.0mL/min，柱温30℃。结果：小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷线性范围为4.004～40.04μg(R2=0.9996)，平均加样回收率为98.1%；芹菜素的线性范围为1.996～19.96μg(R2=0.9990)，平均加样回收率为98.4%。结论：该方法操作简便，结果准确，可作为复方鹅绒藤中该两种成分的含量测定方法。

鹅绒藤；白花菜籽；小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；含量

复方鹅绒藤是由鹅绒藤、白花菜籽等药组成的民间验方，是以新疆特产鹅绒藤药材为主药的在研新药，主要外用治疗肩周炎、腰肌劳损等多种外周关节炎性疼痛。根据复方鹅绒藤的药味组成及其制备工艺，本研究在鹅绒藤[1-2]、白花菜籽化学成分分离鉴定的基础上，采用高效液相色谱建立该方中两种黄酮类成分的含量测定方法，为复方鹅绒藤的质量控制标准提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ME215S型电子天平(德国Starorious公司)；MP2002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。1.2 材料 鹅绒藤茎叶(批号：ER130901)采自新疆维吾尔自治区石河子市郊，白花菜籽(批号：BZ140301，购自湖北武汉市)，经苏州大学药学院陆叶博士鉴定依次为鹅绒藤(CynanchumchinenseR.Br.)茎叶及白花菜(CleomegynandraL.)的种子。复方鹅绒藤提取物(批号：FE140501)按相应处方工艺，采用鹅绒藤和白花菜籽经醇提、减压浓缩、大孔树脂精制、减压浓缩和干燥获得。

小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品为自制，从鹅绒藤中分离得到[1]；芹菜素对照品为自制，从白花菜籽中分离得到，并经与相应化合物[1]NMR数据比较确定。两种对照品经HPLC检测，按峰面积归一法计算其纯度均大于98%。乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，纯水(娃哈哈)，其余试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷10.01mg、芹菜素9.98mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容制成相应对照品储备液A、B。分别依次精密量取对照品储备液A 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，对照品储备液B 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于50mL容量瓶中，甲醇定容配制成系列小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素混合对照品溶液1～6。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 复方鹅绒藤供试品溶液 精密称取复方鹅绒藤提取物29.42mg于50mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

2.2.2 药材供试品溶液 参照复方鹅绒藤提取物相应工艺进行制备。分别精密称定鹅绒藤药材9.94g、白花菜籽药材11.48g，各用75 %乙醇100mL加热回流提取两次，提取液合并，减压浓缩至约40mL，上样于AB-8大孔树脂柱，依次用水200mL、70 %乙醇100mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液、减压浓缩至约25mL，转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容，得储备液；分别精密量取该储备液2mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，即得到相应鹅绒藤、白花菜籽供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：0.1 %乙酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15min，18%～25%B；15～16min，25%～45%B；16～25min，45% B～60% B；25～30min，60%～80%B)；流速：1.0mL/min；检测波长：330nm；柱温：30℃；进样量：20μL。在此色谱条件下，各相邻色谱峰之间分离度均大于1.5。见图1。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下6个不同质量浓度的混合对照品溶液1-6，分别进样20μL，以峰面积积分值(y)为纵坐标，进样质量(x)为横坐标，进行线性回归，测得小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素的线性方程分别为y=17.72x+9.062，R2=0.9996；y=29.37x-23.52，R2= 0.9990。结果表明小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素分别在4.004～40.04μg、1.996～19.96μg范围呈线性关系。2.5 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液3号20μL，连续进样6次，计算小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素峰面积的RSD，分别为1.54 %、2.32%。结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 分别精密吸取同一复方鹅绒藤供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8h进样测定，结果小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的峰面积RSD分别为1.37%、1.58%，表明稳定性良好。

2.7 重复性实验 取同一批次复方鹅绒藤样品6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备复方鹅绒藤供试品溶液，进样20μL，计算小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量为39.68mg/g，峰面积RSD为2.12%；芹菜素含量为6.532mg/g，峰面积RSD为2.24%，结果表明重复性良好。

2.8 加样回收实验 精密称取“2.7”项下已知含量的同一批次复方鹅绒藤样品6份于50mL容量瓶中，每份约15mg，精密加入1mL混合对照品溶液(其中含小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.5005mg/mL，芹菜素0.0998mg/mL)，用甲醇定容，进样20 μL测定，计算两种成分回收率(表1)。测得平均回收率分别为98.1%、98.4%，RSD值分别为0.51%、0.58 %。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品测定 将“2.2”项下三种供试品溶液按照以上条件进样，记录芹菜素和小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的峰面积，计算样品质量分数。实验结果见表2。

表2 样品测定结果 (mg/g,n=3)

3 讨论

复方鹅绒藤是由鹅绒藤、白花菜籽等药物组成的在研新药。方中鹅绒藤作为该方主药，主产于甘肃、内蒙、宁夏、新疆等西北地区，药用根及新鲜茎的乳汁，乳汁外敷可治疗疣赘[3]，其茎叶及其中的黄酮苷类成分具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5-6]等活性。本课题前期已对鹅绒藤茎叶中的黄酮类成分进行了分离鉴定[1]，对其中的小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等主成分进行含量分析[2]。白花菜籽中主要含有黄酮、生物碱等成分，具有抗炎镇痛、抗菌等作用[7]，但未见相关含量测定报道。通过对白花菜籽中的主要成分进行液相分析和分离纯化，经NMR鉴定并与相关文献数据[1]对照确证为芹菜素。在此基础上，根据复方鹅绒藤的药味组成及其制备工艺，本文采用高效液相色谱首次建立了该方中两种黄酮类成分的含量测定方法(图1)。该方法操作简便，结果准确，方法学评价可行，可为复方鹅绒藤及其中的鹅绒藤、白花菜籽两种药材的质量控制标准提供参考。

[1]冯建勇, 陈虹, 孙燕, 等．鹅绒藤地上部位化学成分研究[J]．中国现代应用药学, 2013, 30(3): 274-277．

[2]冯建勇, 孙燕, 陈虹, 等．HPLC法同时测定鹅绒藤中2种黄酮类成分的含量[J]．中国药房, 2013, 24(23): 2175-2177．

[3]马艳, 周凤琴. 民间药鹅绒藤化学成分药理及临床应用研究概况[J]. 中华中医药学刊, 2010, 28(2): 289-291.

[4]许红平, 水栋, 徐泉, 等. 鹅绒藤醇提物各组分清除自由基的研究[J]. 时珍国医国药, 2014, 25(7): 1558-1559．

[5]李洋, 王琦. 鹅绒藤三种单体化合物体外抗肿瘤活性的研究[J]. 宁夏医科大学学报, 2013, 35(6): 622-625．

[6]李洋, 王琦. 鹅绒藤中的黄酮苷类诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J]. 宁夏医科大学学报, 2014, 36(1): 17-20．

[7]吕帮玉，何玉池．白花菜的研究进展[J]．现代农业科技, 2014, (3): 74-75．

(编辑：程鹏飞)

Determination of Two Flavonoids in Compound Cynanchum Chinensis Extract by HPLC

WANG Zengshang1LI Qiang2SHENG Fangting1ZHAXI Baizhen1LIU Jiangyun1*CHEN Hong1

1. College of Pharmaceutical Sciences, SooChow University,Suzhou 215123, China;2. School of Pharmacy, Shihezi University,Shihezi 832000, China

Objective To establish a method for determination of both tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin in Compound Cynanchum Chinensis Extract by HPLC. Method A HPLCsystem was applied, using a Cosmosil C18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm,5μm) column; mobile phase consisted of cetonitrile-1% acetic acid aqueous solution under gradient elution; the detection wavelength was set at 330 nm; the flow rate was 1.0 mL/min and thetemperature of column was maintained at 30℃. Results As for tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin, the linear range was between 4.004～40.04μg (R2= 0.9996) and 1.996～19.96μg (R2=0.9990), with average recovery rate to be 98.1% and98.4% respectively.Conclusion The method developed is simple, rapid with reliable results. The contents of both tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin could be quantified simultaneously, which may be applied for the quality control of the Compound Cynanchum Chinensis extract.

CynanchumChinensis;Cleomegynandra;Tricin-7-O-β-D-Glucuronide;Apigenin;Determination

2016-07-25

新疆生产建设兵团科技援疆专项(2014AB046)。

王増尚(1992-)，男，壮族，硕士研究生在读，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail:1207756820@qq.com

刘江云，博士，副教授，主要从事天然产物研究与开发。E-mail：liujiangyun@suda.edu.cn

R248.1

A

1007-8517(2016)20-0030-03