基于实时荧光PCR的鹅鸭混合绒定量检测

吕蓉+张冠楠+费静+高琴+刘月明+宋青

摘要：传统的羽绒品种定量检测方法为显微镜检测法，费时长且依赖检测人员的经验。本研究建立了基于实时荧光PCR技术的鹅鸭混合绒定量检测方法。通过设计针对鹅、鸭线粒体DNA序列的特异性引物和TaqMan探针，且两组引物探针具有几近相同的扩增效率，建立羽绒品种检测的定量标准曲线（R2>0.99）。以不同产地的鹅鸭混合绒验证该方法，均得到较好结果，证明线粒体拷贝数对定量结果基本没有影响。该方法有望用于羽绒品种的大批量快速定量检测。

关键词：鹅绒；实时荧光PCR；物种鉴定；定量分析

中图分类号：TS959.16；TS07 文献标志码：A

Quantitative Analysis of Goose and Duck Down Blends with Real-time PCR

Abstract： In this project， a quantitative method based on real-time PCR technique was developed to determine the weight of goose down and duck down in down products. Two sets of primers and TaqMan probes that can react specifically to goose and duck mitochondrial DNA were designed， and they exert almost the same amplification rate. The two systems were used to establish the quantitative standard curve of down species determination（R2>0.99）. Goose and duck down blends collected from different producing areas were employed to verify the method， and satisfactory results were obtained， which proved that the copy number of mitochondrion has little impact on quantifying results. The method can be applied to quick and large-batch quantitative identification of down species in down products.

Key words： goose down； real-time PCR； identification of species； quantitative analysis

在羽绒产业中，很大部分是作为纺织填充材料的鹅绒和鸭绒。鹅绒与鸭绒相比绒朵大，蓬松度高，保暖性强，因而在市场上鹅绒的价格比鸭绒更高。有些不法羽绒商贩就企图以鸭绒冒充鹅绒来获取巨大的经济利益。因此世界各国的羽绒标准都对鹅绒中的鸭绒含量作了最高限定。目前国内外普遍采用显微镜法来区分鹅鸭绒，然而显微镜检测费时费力，且受人为经验影响大，不适宜大批量样本的分析。目前也有部分学者运用光谱检测分析技术开展鹅鸭混合绒的鉴别研究，但离实际推广应用还有一定的距离。

自1985年PCR技术诞生起，分子生物学检测方法以其客观性和精准性在食品检验、医疗诊断及司法鉴定等领域得到了广泛的应用，并已开始运用于天然动物纤维的鉴定和检测。费静等开展了兔毛、狐狸毛的实时荧光PCR检测方法研究。Ji等运用实时荧光PCR技术建立了羊毛羊绒混合物的定量检测方法。但目前世界上还没有基于实时荧光PCR技术开展鹅鸭混合绒定量检测研究的报道。家鹅分中国鹅和欧洲鹅两个系统，中国鹅是由鸿雁驯养而成，欧洲鹅则起源于灰雁。家鸭则主要是由绿头鸭和斑嘴鸭培育形成。因此设计能横跨两个物种并相互区别的高效特异性引物和探针是本研究的关键点。

1实验部分

1.1试剂

2%CTAB缓冲液；苯酚/氯仿（上海生工公司）；DTT（二硫苏糖醇）溶液和蛋白酶K溶液（美国Promega公司）；TaqMan Gene Expression Master Mix（美国ABI公司）；引物和TaqMan探针由上海英骏公司合成。

1.2仪器

6870冷冻研磨仪（美国SPEX公司）；恒温震荡孵育器和冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Vii7荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3试样

纯白鹅绒和纯白鸭绒均购自上海民强羽绒厂，且经显微镜检测确认。建立定量标准曲线的羽绒样品为人为混合样品，在常温常湿条件下将纯鹅绒和纯鸭绒配成重量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8，共8个混合比例梯度，每个样品约2g。用于验证实验的中国灰鹅绒、中国白鹅绒、波兰白鹅绒、保加利亚灰鹅绒、法国白鹅绒均为本实验室留存样品。

1.4实验方法

1.4.1羽绒的前处理

将样品混匀，用剪刀稍作剪碎，用冷冻研磨仪将样品磨成面粉状。研磨程序：预冷5min，10Hz运行1min，冷却1min，共3个循环。

1.4.2DNA的提取

称取30mg羽绒粉末样品于2mL离心管中，加入0.8mLCTAB缓冲液，再加入150μLDTT和50μL蛋白酶K，震荡混匀，56℃500r/min震荡过夜。取出离心管，加入1mL苯酚/氯仿，上下颠倒1min以混合均匀。12000r/min离心10min，吸取900μL上清置于新2mL离心管，加入等体积苯酚/氯仿，上下颠倒1min以混合均匀。12000r/min离心10min，吸取800μL上清置于新2mL离心管，加入800μL氯仿，上下颠倒1min以混合均匀。12000r/min离心10min，吸取700μL上清置于新1.5mL离心管，加入500μL异丙醇，上下颠倒10次。4℃、12000r/min离心30min，倾倒离心管去除异丙醇，加入1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，小心倾倒出溶液。重复洗涤1次，尽可能去除洗涤液。打开盖子，离心管置于空气中干燥直到无气味。加入100μL超纯水，高速涡旋振荡15s以溶解DNA。

1.4.3引物和探针的设计

根据NCBI中已发表的鸿雁和灰雁、绿头鸭和斑嘴鸭的线粒体基因组序列（登录号：KP238480.1，NC_011196.1，EU009397.1，NC_022418.1），兼顾鸿雁和灰雁两者线粒体基因的相同部分，与绿头鸭和斑嘴鸭的相应区域序列进行比较，选取合适的序列进行引物探针设计，如表1所示。

1.4.4实时荧光PCR扩增

反应体系为25μL，包括TaqManGeneExpressionMasterMix12.5μL，引物各0.4μmol/L，探针0.2μmol/L，DNA模板5μL。PCR扩增条件：95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，共40个循环。用ABIVii7荧光定量PCR仪进行检测。

2结果与讨论

2.1鹅源性成分和鸭源性成分引物探针的特异性检测

分别以纯鹅绒DNA、纯鸭绒DNA和ddH2O为模板进行实时荧光PCR扩增。鹅源性成分的引物探针检测体系与鸭绒DNA有微弱的交叉反应，而鸭源性成分的反应体系与鹅绒DNA也有较弱的交叉反应，但两者Ct值（PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段并达到阈值所经历的循环次数）之差均约为14，远大于10，交叉反应DNA的相对等效浓度小于0.1%，对后续的定量影响不大。两者的扩增曲线如图1、图2所示，？Rn为标准信号与基线信号差值。

2.2鹅源性成分和鸭源性成分引物探针的灵敏度检测

对纯鹅绒DNA、纯鸭绒DNA分别进行10倍梯度稀释，用相应引物探针检测灵敏度。由检测结果可知：纯鸭绒DNA、纯鸭绒DNA经104稀释仍能检测到荧光信号。两者的梯度稀释标准曲线如图3所示。且两条标准曲线的斜率相近，由此表明鹅、鸭检测体系的PCR扩增效率基本趋于一致，该检测体系可以用于建立定量标准曲线。

2.3定量标准曲线的建立

根据荧光定量PCR的数学原理，当两个反应的扩增效率非常接近时，可以近似地认为鹅绒与鸭绒比值的对数与两者对应的Ct值之差存在线性关系。提取鹅绒含量为90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%的鹅鸭混合绒DNA，以鹅绒和鸭绒比值的对数为横坐标，以3个独立批次样品的鹅绒Ct检测值和鸭绒Ct检测值之差的平均值为纵坐标，取点进行曲线拟合，得定量标准曲线（图4），且R2>0.99。对于需定量的样品，每次测得鹅绒鸭绒各自的Ct值，利用标准曲线公式，即能得出混合绒中鹅绒的含量。

2.4方法验证

2.4.1定量标准曲线的重复性验证

将纯鹅绒与纯鸭绒以85%鹅绒、60%鹅绒、20%鹅绒的投入量混合，各自取8个独立的样本，检测鹅绒鸭绒各自的Ct值，并通过定量标准曲线计算其中的鹅绒含量，结果如表2所示，总体来讲该方法的重复性较好。

2.4.2实际样品的验证

考虑到线粒体拷贝数在不同生物品种和不同组织中的数目可能也不同，而鹅绒鸭绒线粒体数量的稳定性是本定量方法是否准确的关键。同时动物纤维中所含的天然色素也可能会抑制PCR反应的进行，进而影响本方法的有效性。为验证该方法的准确性，采用不同地区和不同颜色的已知鹅绒含量的鹅鸭混合绒，每个样品均做平行样，经实验得出鹅绒的比例，结果见表3。可以看到，作为鹅绒主要产区的中国和欧洲，来源于不同品种的鹅绒和鸭绒，其线粒体DNA的相对含量没有很明显的差异；且鹅鸭绒中所含的天然色素对PCR反应基本没有影响。

3结论

对天然动物纤维而言，DNA检测方法不依赖于纤维固有的形态结构及其他理化性质，而是依据物种自身的特异性核苷酸序列开展检测，因而不受检测人员的主观判断及经验影响，结果更为准确和可靠。本方法利用鹅、鸭线粒体DNA序列上的差异，设计特异性好、灵敏度高的引物和探针，建立高效、可靠的鹅鸭混合绒实时荧光PCR定量检测方法。比起传统显微镜的定量方法，该方法可进行批量样本的检测分析，更为省时、省力，同时具有更高的可靠度和准确性，对保护我国羽绒企业对外贸易的顺利开展有着重要的意义。

参考文献

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作者简介：吕 蓉，女，1982年生，工程师，从事动植物分子生物学检测技术的研究。

作者单位：上海出入境检验检疫局。

基金项目：上海出入境检验检疫局科研项目（HK007-2014）。