维药野西瓜对胶原诱导型关节炎大鼠模型的治疗机制研究

李培奇 周文涛 娜尔给扎·艾尔肯 甫拉提·热西提 褚 冰 陈恒硕 王 雪 周晓涛*

1.新疆医科大学厚博学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第五附属医院中医科，新疆 乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学临床学院，新疆 乌鲁木齐 830054；4.新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830054



维药野西瓜对胶原诱导型关节炎大鼠模型的治疗机制研究

李培奇1周文涛2娜尔给扎·艾尔肯3甫拉提·热西提4褚 冰1陈恒硕1王 雪1周晓涛4*

1.新疆医科大学厚博学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第五附属医院中医科，新疆 乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学临床学院，新疆 乌鲁木齐 830054；4.新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830054

目的：通过胶原型诱导型关节炎(CIA)大鼠模型，初步研究维药野西瓜对类风湿性关节炎的抗炎机制。方法：构建II型胶原诱导型关节炎大鼠模型，观察维药野西瓜治疗前后CIA大鼠足踝肿胀程度及踝关节组织病理的改变；ELISA法检测大鼠血清中TNF-α表达水平的变化；免疫组化法检测大鼠足踝关节组织中TNF-α的表达。结果：维药野西瓜可有效缓解CIA大鼠关节的肿胀情况，减缓组织炎症发展；药物作用25d后，与模型组血清中TNF-α含量(60.8±13.5)ng/mL相比，维药野西瓜处理组血清中TNF-α的含量(43.9±2.6)ng/mL明显降低；与模型组相比，维药野西瓜治疗组大鼠足踝关节组织中TNF-α的表达也明显减少。结论：维药野西瓜对CIA大鼠具有较好的抗RA作用，其作用机制可能与降低血清及组织中的TNF-α水平有关。

类风湿性关节炎；维药野西瓜；CIA大鼠模型；TNF-α

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以累积周围关节为主的多系统慢性炎症性自身免疫疾病，可导致不可逆的关节软骨和骨破坏，甚至关节畸形和残疾[1]。RA的发病机制至今仍未证实，近年来研究显示RA的发病机制可能与感染、遗传和内分泌等有关，但临床上依然缺乏特异性治疗措施，尚无治愈方法。维药野西瓜(Capparis Spinosal)广泛分布于新疆天山南北，其为新疆维吾尔医治疗类风湿性关节炎、痛风及疮毒等疾病的外敷用药，具有祛风除湿，止痛消痛的作用。研究通过构建大鼠Ⅱ型胶原诱导型关节炎模型(Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis，CIA)，观察维药野西瓜外敷法对CIA型关节炎大鼠左足踝关节肿胀程度、组织病理、细胞因子TNF-α在血清与组织中的表达，对维药野西瓜抗胶原型关节炎大鼠模型的效果及作用机制进行初步探讨。

1 仪器与材料

1.1 动物 清洁级雌性Wistar大鼠40只,7～9周龄，体重(200±15)g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2 仪器 游标卡尺(最小刻度为0.2mm，上海精密仪器厂)； Labsystems Dragon wellscanMK3酶标仪。

1.3 材料 维药野西瓜(新疆新特药有限公司提供，新疆医科大学药学院生药系鉴定)；雷公藤多甙片(批号：140701，上海复旦复华药业有限公司)；酸溶性型牛Ⅱ胶原(美国Sigma公司)；弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvent，FCA，美国Sigma公司)；ELISA大鼠TNF-α定量试剂盒(ebioscience公司)；anti-TNF-α抗体(武汉博士德公司)；DAB显色试剂盒(北京金杉公司)。

2 方法

2.1 动物模型的分组、构建及给药 将40只Wistar雌性大鼠随机分为4组：空白对照组(NS)、模型组、雷公藤甙治疗组及野西瓜治疗组。根据参考文献[2]，配制IFA：完全佐剂 (FCA)石蜡=1∶2，造模前模型组将酸溶性型牛Ⅱ胶原与IFA等体积进行混合、乳化。在大鼠左侧后足跖肉垫处皮内注射 0.1mL混悬乳剂致敏，背部皮内注射0.05mL混悬乳剂致敏，每天测量足趾肿胀程度，7d后在鼠尾根部注射相同乳剂加强1次。正常对照组在相同的部位注射 0.1mL灭菌石蜡。致敏2周后，成功建立CIA型关节炎大鼠模型，参照关节炎指数评分标准[3]对模型复制效果进行评估，评分达6分以上的大鼠用于实验。阳性对照组给予雷公藤甙(0.01mg/kg)灌胃治疗；治疗组为维药野西瓜粗提取物加白酒及蛋清混匀(45°白酒∶蛋清=1∶2，5%维药野西瓜打粉粗提物)，用纱布包裹于大鼠左后足踝进行治疗，隔日一次换药；正常对照组及模型组以生理盐水灌胃，每日一次。

2.2 取材 治疗25d后取材，处死大鼠，采取大鼠腹主动脉采血，将其左右足踝关节的滑膜组织用10%甲醛溶液进行固定。

2.3 观察检测 用游标卡尺每日测量大鼠左后足踝关节的上下径并记录数据，观察其肿胀程度(精确至0.2mm)；同时镜下观察大鼠左后足踝关节滑膜组织病理切片(HE染色)变化，ELISA法观察血清中TNF-α的变化，免疫组化法观察足踝关节组织TNF-α的表达水平。

2.4 免疫组化结果评分 采取每张切片随机观察具有代表性的10个高倍镜视野，根据胞膜胞质染色程度及染色细胞百分比进行评分：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞百分比≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分比得分相乘为其最后得分，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，≥4分为强阳性(++)。

3 结果

3.1 对CIA大鼠足踝关节肿胀程度的影响 维药野西瓜对CIA大鼠踝关节的急性炎症反应有较好抑制作用。与空白对照组比较，造模后第14天(药前)各组踝关节均明显肿胀(P<0.01)，表明造模成功。用药第25天后，雷公藤甙组及维药野西瓜对大鼠右足踝关节肿胀均有明显的缓解作用(P<0.05)。见表1。

表1 维药野西瓜外敷法对Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠关节肿胀程度的影响 ±s，n=10)

注：与空白对照组(NS)比较，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

3.2 组织病理切片观察 HE染色组织切片镜下可见，正常组大鼠关节组织无淋巴细胞浸润及毛细血管的增生；CIA大鼠模型组可见到淋巴细胞浸润，同时滑膜细胞增殖，毛细血管的增生，软骨组织破坏严重；而雷公藤甙治疗组和维药野西瓜外敷组镜下观察可见软骨组织破坏减轻，淋巴细胞浸润明显改善。见图1～4。

3.3 外周血中TNF-α含量变化 由图5可知，与正常对照组外周血中TNF-α含量(51.8±10.1)ng/mL比较，模型组大鼠外周血中TNF-α含量(60.8±13.5)ng/mL明显升高，差异有统计学意义(t=-2.582，P<0.05)。雷公藤甙治疗组大鼠外周血中TNF-α含量为(47.5±7.4)ng/mL、维药野西瓜治疗组大鼠外周血中TNF-α含量为(43.9±2.6)ng/mL，均明显低于模型组，差异有统计学意义(t值分别为-3.265、-2.601，P<0.05)。

3.4 足踝关节组织中TNF-α表达水平变化 由图6可见，CIA关节炎大鼠模型组足踝关节组织中TNF-α表达明显升高(Z=-3.00，P<0.05)。与模型组相比，雷公藤甙治疗组及维药野西瓜治疗组大鼠踝关节组织中TNF-α表达水平明显下降(Z值分别为-2.449、-2.362，P<0.05)。

4 讨论

类风湿性关节炎的临床表现主要为关节滑膜慢性炎症反应，该病具有诊断不易，易反复发作的特点。治疗不佳的患者可随着病情发展，逐渐侵害关节，直至关节畸形，甚至功能丧失，因此早期干预有利于延缓病情进展，对改善患者预后具有重要意义[2]。RA从组织病理变化上而言可能涉及关节腔滑膜炎症、细胞增生、炎性细胞浸润、肉芽肿形成、软骨及骨组织破坏等多个环节，目前尚无特效治疗措施[3]。

维吾尔医药用植物野西瓜，因多分布于新疆南北坡地而最早报道于《新疆中草药》，其维文名为：开派、菠里科果，在沙特阿拉伯做为传统药物常被用作治疗风湿病、关节炎和痛风等；在维吾尔医学中，野西瓜被认为具有祛风除湿、散寒除湿、消肿止痛的功效，常被作为治疗类风湿性关节炎的药物。近年来，野西瓜经过粗提取后的临床应用已引起国内外研究者的关注。有研究已表明[4]，维药野西瓜可缓解佐剂型关节炎大鼠的关节肿胀，降低外周炎性因子的水平。Ⅱ型胶原诱导型关节炎模型(type Ⅱ collagen induced arthritis)由Trentham等于1977年首次建立，并随研究的不断深入和相关实验的大量重复，目前已成为公认的研究人类类风湿关节炎的经典模型[5]。CIA模型在病证表现性更加的稳定、持久[6]，并更接近于人类的RA模型，具有研究的代表性和经典性。实验依据参考文献[2]，免疫2周后成功构建CIA大鼠模型。参照关节炎指数评分标准[7]对模型的复制效果进行评估，评分达6分以上。结果显示：与对照组比较，造模后第2周(给药前)各组踝关节均明显肿胀，CIA大鼠模型制备较为成功(P<0.01)。药物干预第25天时，模型组CIA大鼠足踝关节直径为(10.05±0.5)mm，雷公藤治疗组及野西瓜治疗组大鼠足踝关节的肿胀程度明显减轻，分别为(9.33±0.8)mm、(8.72±0.7)mm，差异具有统计学意义(P<0.05)。从组织切片上也可以看出，野西瓜治疗组大鼠软骨组织破坏减轻，淋巴细胞浸润得到明显改善。

肿瘤坏死因子(TNF-α)通常由单核细胞及巨噬细胞分泌。做为主要前炎症因子，TNF-α对关节实质细胞和内皮细胞具有广泛作用，在形成RA炎症、新生血管生成和骨质减少过程中起着重要作用[8]：TNF-α可促进趋化因子的合成和分泌、增加细胞黏附分子的表达，从而加速淋巴细胞和单核细胞的募集[9]。TNF-α也可促进提呈抗原肽的MHCⅡ类分子表达，通过促进对自身抗原的反应激活T细胞，继而诱导结缔组织细胞，包括滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素E2(PGE2)和基质金属蛋白酶(MMP)，致滑膜炎症和增生、软骨破坏[10]。TNF-α还可促进 RA滑膜细胞的凋亡[10]。有研究显示RA患者血和病变关节滑液中 TNF-α水平随同期关节炎活动指数的改善而显著下降，使用抗 TNF-α单抗治疗后，RA患者病变关节内的滑膜炎和软骨破坏得以抑制，患者症状体征明显减轻[10]。实验中利用ELISA实验及免疫组化实验，试图从血清学水平及组织学水平上分别对CIA大鼠血清及组织中TNF-α的表达情况进行检测。结果显示，药物处理25天后，正常对照组血清中TNF-α含量为(51.8±10.1)ng/mL，CIA模型组大鼠血清中TNF-α为(60.8±13.5)ng/mL，与正常组相比明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)；雷公藤甙治疗组大鼠外周血中TNF-α为(47.5±7.4)ng/mL，维药野西瓜治疗组为(43.9±2.6)ng/mL，与CIA模型组相比，两者均明显降低(P<0.05)，但两者之间差异无统计学意义。结果提示维药野西瓜可通过降低CIA大鼠血清中TNF-α水平起到抗RA的作用。免疫组化技术是利用抗原抗体特异性反应对组织细胞中的特定抗原(或抗体)进行定位和定性的一种染色技术，具有直观的特点。免疫组化实验结果显示CIA模型组大鼠在关节滑膜组织上TNF-α表达明显增高 (P<0.05)；与模型组相比，雷公藤甙治疗组及维药野西瓜治疗组大鼠踝关节组织中TNF-α表达水平明显下降 (P<0.05)。ELISA及免疫组化实验结果提示抑制血清及足踝关节组织中TNF-α的表达可能是维药野西瓜抗类风湿性关节炎的作用机制之一。

综上所述，维药野西瓜可有效减轻CIA大鼠模型的足趾肿胀程度，缓解病理损害，其机制可能与降低血清及组织中的TNF-α水平有关。RA 的发病机制目前尚未明确，临床治疗手段较局限，通过现代的研究手段和方法运用，来发掘特色维药的独特治疗效果，有利于进一步研究并阐明维药野西瓜在抗类风湿关节炎中的作用及机制，以期在类风湿性关节炎的研究及诊治上取得新进展。

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(编辑：陶希睿)

Research on the Mechanism of Capparis Spinosalagainst Rheumatoid Arthritis by Collagen Induced Arthritis Rat Model

LI Peiqi1ZHOU Wentao2NARgezha·Arken3FUlati·Rexiti4CHU Bing1CHEN Hengshuo1WANG Xue1ZHOU Xiaotao4*

1.HouBo College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China;2.The Department of Traditional Chinese Medicine in the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China；3. Clinical College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China;4.Basic Medical College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Objective To study the mechanism of Capparis Spinosal against rheumatoid arthritis(RA) by the Collagen induced arthritis rat model.Methods After establishing CIA rat model, the Capparis Spinosal’s antiarthritic effects against RA were studied through observing the changes of ankle swelling, pathology of anklebone and observing the levels of TNF-α in serum and tissue after medication. Results Capparis Spinosal could effectively inhibits articular swelling, decrease inflammatory in tissue of CIA rats.After Drugs had been used for 25 days, compared to the content of TNF-α in the serum of the model group ( 60.8±13.5)ng/mL, the content of TNF-α in the serum of the Capparis Spinosal therapy group(43.9±2.6)ng/mL decreased significantly; the expression of TNF-α decreased obviously in the Capparis Spinosal therapy group compare to the model group.Conclusion Capparis Spinosal had antiarthritic effects to CIA rat model, the possible mechanism may be related to the level of TNF-α decreased.

Rheumatoid Arthritis；Capparis Spinosal；Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis Rat；TNF-α

2016-08-05

新疆医科大学大学生创新课题(CX2015061)；新疆维吾尔自治区大学生创新创业训练计划(201510760061)；自治区卫生计生委青年科人才专项资金科研项目(2015Y41)。

李培奇(1994-)，男，汉族，本科在读。E-mail:362496355@qq.com

周晓涛(1981-)，女，汉族，副教授，硕士生导师，主要从事中维医药免疫机制研究。E-mail：xiaotaozhou9@sina.com

R593.22

A

1007-8517(2016)20-0009-04