HPLC测定及比较大青叶与板蓝根中靛玉红含量

梁青云　梁真宝　黎艳光　李海怡　李喜兰

（吉林大学珠海学院，广东珠海　519100）

HPLC测定及比较大青叶与板蓝根中靛玉红含量

梁青云梁真宝黎艳光李海怡李喜兰*

（吉林大学珠海学院，广东珠海519100）

目的：采用了高效液相色谱法对大青叶和板蓝根中的靛玉红进行测定并测定靛玉红在大青叶及板蓝根中的含量，再对两者的靛玉红含量进行比较。方法：采用反相C18色谱柱（4.6mm×15cm），柱温30℃，流动相为甲醇-水（65：35），检测波长285nm，进样量10μl。结果：检测出在大青叶和板蓝根中均可提取出靛玉红成份，而大青叶中靛玉红含量多于板蓝根中的靛玉红含量近乎4倍。结论：在今后对于靛玉红的研究不再仅限于板蓝根之中，大青叶也可以作为很好的研究药材对象。

大青叶板蓝根菘蓝靛玉红高效液相色谱法

0　引言

大青叶与板蓝根均属十字花科植物——菘蓝（Isatis indigotica Fortune），大青叶即为菘蓝的干燥叶，临床上大青叶可用于治疗各种病毒性流行性感冒、乙肝脑炎和流行性腮腺炎等传染性疾病［1］。板蓝根即为菘蓝的干燥根，可用于治疗温病发热、发斑、咽喉肿痛、流行性乙型脑炎等症，近年来现代药理也明确了板蓝根在抗细菌内毒素、抗炎抑菌、抗病毒等方面的作用［1］［2］。而靛玉红作为大青叶与板蓝根抑菌、抗炎作用的有效成份之一，靛玉红就有具有抑菌、解热、抗炎等作用，且能够治疗慢性粒细胞白血病、抗肿瘤等。本实验将采用四氢呋喃分别提取大青叶和板蓝根中的有效成份，以靛玉红标准样品为对照品并用HPLC对大青叶和板蓝根的提取液进行测定，同时对测得两者靛玉红的含量进行比较。

另外，刘远［3］鉴定的靛玉红结构数据：紫红色针状结晶（氯仿），m p＞300℃。ESI-MS m/z：547［2M+Na］+。H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.99（1H，s，NH）、10.87（1H，s，NH）、8.75（1H，d， J=7.8H z，H-4'）、7.64（1H，d，J=7.6H z，H-4）、7.56（1H，t，J=7.8Hz，H-6'）、7.40（1H，d，J=7.8Hz，H-7'）、7.24（1H，t，J=7. 6Hz，H-6）、7.00（2H，t，J=7.8Hz，H-5，5'）、6.89（1H，d，J=7.6 Hz，H-7）；13C-NMR（100MH z，DMSO-d6）δ：188.6（C-3）、170.9（C-2'）、152.5（C-7a）、140.9（C-7'a）、138.3（C-2）、137.1（C-6）、129.3（C-4'）、124.6（C-4）、124.3（C-6'）、121.4（C-3' a）、121.2（C-5，C-5'）、119.0（C-3a）、113.4（C-7）、109.6（C-T）、106.5（C-3'）等提供了更多关于靛玉红结构信息，在以下试验中更有效地采用适当的试验方法进行。

靛玉红化学结构如图1：

1　材料与方法

1.1材料

大青叶（安徽）；板蓝根（安徽）。

1.2试剂

靛玉红标准品（含量97%，上海源叶生物科技有限公司）；四氢呋喃（GR，上海晶纯生化科技股份有限公司）；四氢呋喃（AR，郑州广杰化工有限公司）；甲醇（GR，广州市昱浩贸易有限公司）。

1.3仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DHG-9140A型恒热鼓风干燥箱（上海一恒科技仪器有限公司）；DHT型磁力搅拌电热套（山东省菏泽市祥龙电子科技有限公司）；蒸馏装置（实验室自制）；索氏提取器装置（实验室自制）。

1.4样品配制

（1）大青叶中有效成份的提取。精密称取10g干燥大青叶，滤纸包好装入搭好的索氏提取装置，在500m L平底烧瓶加入250m L四氢呋喃溶液（AR），采用连续回流的方法回流4h。得到的提取液减压蒸馏至粘稠状，定容至5m L，为叶提取液。（2）板蓝根中有效成份的提取。取足够的干燥板蓝根搅碎成粗粉，过40目筛，精密称取10g板蓝根粉，加入25m L四氢呋喃溶液（AR），回流4h。减压过滤得到的提取液蒸馏浓缩至粘稠状，用四氢呋喃（AR）定容至5m L，为根提取液。（3）HPLC靛玉红标准溶液的配制。称取5mg靛玉红标准品，加入四氢呋喃（GR）溶解定容至100m L。分别取上述靛玉红溶液1.0、2.0、3.0、4. 0、5.0m L于5个5m L容量瓶中，用四氢呋喃（GR）定容，即得浓度分别为10、20、30、40、50μg/m L的靛玉红标准溶液。

表1　HPLC测定靛玉红标准曲线数据表Tab.1　HPLC determ ination of indirubin standard curve data tab le

1.5HPLC测定

（1）实验条件［4］色谱柱：反相C18柱4.6mm×15cm，流动相：甲醇-水（65：35），检测波长：285nm，进样量：10μL，柱温：30℃。（2）制作靛玉红标准曲线。在上述色谱条件下，分别精密吸取制得各不同浓度的靛玉红标准溶液注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积对浓度作图得出靛玉红的回归方程。（3）HPLC标准曲线求出大青叶与板蓝根中靛玉红含量。分别将叶提取液、根提取液通过微孔滤膜（0.45μm）滤过，得到滤液。分别吸取滤液10μL注入高效液相色谱仪，按已确定的色谱条件记录峰面积，代入HPLC求得的靛玉红标准曲线回归方程中计算靛玉红的含量。

2　结果

如表1所示，在高效液相色谱检测中，标准样品靛玉红在14m in左右的时间出峰，而检测根提取液和叶提取液时在14m in左右也有较高峰出现，即靛玉红成分。以标准样品靛玉红的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得出靛玉红的回归方程为y=24841x-23869，且R^2=0.99939，因此靛玉红在10-20μg/m L范围内有良好的线性关系。而HPLC测得的试样中靛玉红浓度可通过该回归方程求得如表2所示。

通过表2可得出，靛玉红在大青叶中的含量比在板蓝根中的含量高。由HPLC测得的实验数据，在测定标准样品中靛玉红的色谱图在可以确定大青叶及板蓝根中含有靛玉红成份，而通过大青叶和板蓝根提取液中靛玉红含量的测定和比较，可明显得出靛玉红在大青叶的含量均高于其在板蓝根中的含量，甚至是多出4倍以上。

3　讨论

在实验中可以发现靛玉红在板蓝根中的含量是很少的，反而大青叶中靛玉红的含量相对多，因此在今后对于靛玉红的研究不再仅限于板蓝根之中，大青叶也可以作为很好的研究药材对象。另外在查阅了许多文献之后，发现大部分都是用蒸煮法提取大青叶或者板蓝根的有效成份，故本次实验通过索氏提取器装置等连续回流方法对大青叶的提取，既减少了提取溶液的过滤纯化繁琐步骤，又能保证大青叶和板蓝根中有效成份的提取完全。另外在对于靛玉红的提取及检测在时间、提取仪器精密性检查及改变提取溶剂等方面仍可有再进一步探索和改进。

4　致谢

感谢广东大学生科技创新培育基金及吉林大学珠海学院对本研究的大力支持，让我们能够在优良的实验条件下顺利完成本次实验。感谢吉林大学珠海学院化学与药学系的各位老师及辅导员在学习和生活上为我们提供便利和帮助。

［1］王虹霞，梁剑平，李雪虎，等.HPLC法测定大青叶中靛玉红的含量［J］.湖南农业科学，2012，（03）：87-89.

［2］李霞.板蓝根化学成分及质量控制研究［D］.山西：山西医科大学，201 0.

［3］刘远.马蓝叶化学成分研究［J］.沈阳：沈阳药科大学，2009.

［4］马莉，孙琴，李友，等.HPLC法测定板蓝根药材及制剂中靛蓝和靛玉红含量［J］.药物分析杂志，2010，30（9）：1642-1645.

［5］熊丽，干国平.复方板蓝根颗粒中靛蓝和靛玉红的含量测定［J］.中国药师，2007，10（10）：1047-1048.

［6］董娟娥，龚明贵，梁宗锁.板蓝根、大青叶中靛蓝和靛玉红的测定方法比较［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（2）：215-21 9.

Objective：Used HPLC to determ ine the indirubin content in and to measure the indirubin of Folium Isatidis and Radix Isatidis.Then we compared the both contents of indirubin.Method：The chromatographic separation was performed w ith reversed phase C18chromatographic column（4.6mm× 15cm）and column temperature of30℃.The mobile phase consisted of methanol-water（65：35），the detection wavelength was285nm and10μl of the sample volume.Result：By the HPLC，it can extract the indirubin from.

Folium Isatidis；Radix Isatidis；Isatis indigotica Fortune；indirubin；HPLC

广东省大学生科技创新培育专项基金（NO：pdjh2015b0931）；2015年度大学生创新创业训练计划院级项目（NO：DC2015007）

梁青云（1994—），女，广东茂名人，在读本科生，就读专业为药物制剂，主要研究方向为药物检测。

★李喜兰（1980—），女，大学讲师，主要研究方向为精细化学品。E-mail：405689962@qq.com。