掌叶覆盆子快繁过程中细菌污染的种类及控制

何莹++腾进婧++陈灿灿+　杨华

摘 要 为了降低掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）组培苗的细菌污染的危害，试验分离并研究了几种抗生素控制掌叶覆盆子快繁过程中细菌污染的效果。试验表明：掌叶覆盆子快繁过程中常见的细菌有三种，分别为甲基杆菌 GR3、微杆菌和恶臭假单胞菌F1。在组培苗感染细菌的早期，每升培养基中添加25万单位青霉素和6.25万单位链霉素能有效控制红色菌和黄色菌，且对掌叶覆盆子的生长及生根产生的负面影响最小。头孢噻肟钠对乳白色菌有一定控制效果，但效果有限。

关键词 掌叶覆盆子 快繁 细菌污染 控制

中图分类号：S567.239 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.069

The Types and Control of Bacterial Contamination

during Micropropagation of Rubus chingii

HE Ying[1]， TENG Jinjing[1]， CHEN Cancan[2]， YANG Hua[1]

（[1] College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， CHangsha， Hunan 410128；

[2] International College of Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract In order to reduce palmleaf Raspberry （Rubus chingii Hu） seedlings of bacterial contamination hazards， separation test and study the several antibiotics control of Rubus chingii effect of bacterial contamination in the process of rapid propagation. Experiment shows： Rubus chingii rapid propagation of common bacteria has three， namely methyl coli GR3， micro coli and Pseudomonas putida F1. Bacterial infection in tissue culture seedlings of early， per liter of culture medium added 25 million units of penicillin and 6.25 million streptomycin unit can effectively control the red bacteria and yellow bacteria and of palmleaf raspberry growth and rooting of minimal negative impact. The effect of the control effect of the sodium in the milk white fungus， but the effect is limited.

Key words Rubus chingii； rapid propagation； bacterial contamination； control

掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）又称为华东覆盆子、树莓、牛奶母、大号角公，蔷薇科悬钩子属植物。含有黄酮、甾、醌、生物碱、有机酸、维生素、多酚类等多种化学成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、降血脂等多方面的药理活性。 其甜茶苷口感甘甜，不易吸收，可辅助降血糖， 满足高血糖患者对于甜食的需求。随着国际市场对甜茶苷需求的扩大，掌叶覆盆子的栽培面积急剧增加，组培苗的需求也日益增加。但在培苗扩繁及生根过程中，会出现细菌污染，感染频率高达50%，应采取措施进行有效防控。

抗生素是在微生物代谢过程中产生，在低浓度下就能抑制它种微生物的生长和活动，甚至杀死它种微生物的物质。 以一定浓度的抗生素加入植物培养基中，如青霉素、链霉素、土霉素、四环素等，可达到抑制效果。

本文对掌叶覆盆子快繁过程中常见的细菌进行了分离与鉴定，对不同浓度的医用抗生素降低掌叶覆盆子组培苗的污染进行了研究，旨在完善掌叶覆盆子标准化生产体系，降低大规模生产掌叶覆盆子组培苗感染细菌的风险。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）掌叶覆盆子组培苗。本实验采用掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）为材料。（2）组培污染的杂菌。实验用的细菌从污染的组培苗中分离纯化获得。（3）医用抗生素。青霉素可湿性粉剂（k1，80万单位）、链霉素可湿性粉剂（k2，100万单位）、注射液土霉素（k3，20万单位），头孢噻肟钠（k4，100万单位）（4）培养基。细菌培养基为10 g/L 琼脂的MS培养基，每升MS培养基外加20ml掌叶覆盆子叶子水浸液（80g 叶子加入200ml双蒸水，捣碎，煮沸后纱布过滤，补水至200ml）。组培苗培养基为MS培养基。

1.2 研究方法

1.2.1 细菌的分离及鉴定

在无菌条件下用接种环挑取掌叶覆盆子组织培养过程中典型的红色、淡黄色和乳白色菌，在细菌培养基平板上用划线法分离单菌落。得到单菌落后，再挑取单菌落用划线法进一步分离单菌落。最后置于培养箱中培养18h左右做革兰氏染色鉴定细菌。革兰氏染色鉴定方法参考沈萍等。

16S rDNA测序法鉴定细菌种属。引物为27F ：5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3

1.2.2 医用抗生素母液的配置及使用

配置1万单位/mL的抗生素母液，采用液体倍比稀释法制备不同浓度的抗生素工作液。青霉素标记为K1，链霉素标记为K2，头孢噻肟钠标记为K3，土霉素标记为K4。

1.2.3 抗生素对掌叶覆盆子组培苗叶片、生长及生根的影响

（1）浸泡法：在40ml无菌水添加1ml抗生素母液，用该溶液浸泡组培苗10 min，然后将处理好的组培苗接种于新的培养基中，置于培养室培养。每天记录一次材料叶片、生长或生根状况。（2）直接加入法：分别向掌叶覆盆子组培苗的培养基（规格为40ml/瓶）上直接加入梯度浓度的抗生素溶液1毫升，置培养室培养。每天记录一次材料叶片、生长或生根状况。

1.2.4 抗生素抑菌效果比较

细菌培养基经过高温灭菌后，冷却培养基至不烫手，再按40ml培养基加1ml抗生素溶液的比例将抗生素溶液分别添加到培养基中，然后倒平板。对照以ddH2O代替抗生素溶液。然后用灭菌的牙签将菌点在平板中央。每天观察细菌生长情况，量取菌落直径，并计算抗生素对菌类的生长抑制率。

菌类生长抑制率（%） = [（对照菌落直径-处理菌类直径）/对照菌落直径]€？00

1.2.5 抗生素对掌叶覆盆子组培苗细菌污染的控制

从掌叶覆盆子组培苗中挑选出感菌的材料，加入抗生素配方，每配方处理100瓶，重新置于培养室培养。每天记录。

2 结果与分析

2.1 掌叶覆盆子组培过程中感染细菌的常见种类及革兰氏染色结果

掌叶覆盆子组培的过程中，会出现细菌污染的现象，而且感染频率非常高。但常见的有三种菌，分别为红色、淡黄色、乳白色将红、淡黄、乳白色三种细菌分离纯化后进行革兰氏染色，分别被染色成紫红色、紫红色、红色。鉴定结果表明：红色、淡黄色细菌为革兰氏阳性细菌；乳白色细菌为革兰氏阴性细菌。采用16S rDNA鉴定分离的菌种，红色菌为Methylobacterium variabile strain GR3（甲基杆菌），黄色菌为Microbacterium marinilacus strain YM11-607（微杆菌），白色菌为Pseudomonas putida strain F1（恶臭假单胞菌）。

2.2 抗生素对组培苗叶片的影响

试验数据显示，中等剂量的土霉素和链霉素都有可能导致掌叶覆盆子组培苗黄化。而且以土霉素为甚，最终都会导致材料的死亡。土霉素不适合用于控制掌叶覆盆子组培细菌污染。采用直接加入法更适合用于控制！

2.3 抗生素对组培苗生长、生根的影响

试验数据显示，不同剂量的抗生素对掌叶覆盆子组培苗生长和生根有一定影响，但只有K2-1和K2-2对覆盆子组培苗生长的影响具有显著性特征，K2-1还对覆盆子组培苗生根的影响具有显著性特征。

2.4 不同抗生素的抑菌效果

为了比较分析不同抗生素的抑菌效果，对组培苗生长及生根无显著影响的抗生素进行体外抑菌实验。试验结果显示，K1-1和K1-2能很好地抑制红色菌的生长，其抑制率超过80%，K2-3能较好地抑制红色菌生长，其抑制率超过50%。K1-1，K2-3以及K2-4对黄色菌有较好的抑制效果，其抑制率超过了50%。K3-1和K3-2对乳白色菌有好的抑制效果，其抑制率在60%以上。

2.5 抗生素对掌叶覆盆子组培苗细菌污染的控制效果

通过研究抗生素对掌叶覆盆子组培苗的影响以及抗生素对掌叶覆盆子快繁殖过程中常见菌的抑制作用，我们认为K1-1、K1-2、K2-3、K2-4、K3-1和K3-2可以用于控制掌叶覆盆子快繁过程中的细菌污染。我们选择K1-1、K2-3和K3-1进行组合实验，试验结果表明，红色细菌污染的掌叶覆盆子组培苗应用K1-1处理，其存活率最高；用K1-1+K2-3处理，其生根率最高。黄色细菌污染的掌叶覆盆子组培苗应用K1-1+K2-3处理，其存活率最高且生根率最高。乳白色细菌污染的掌叶覆盆子组培苗应用K2-3+K3-1处理，其存活率和生根率均最高。

3 讨论

植物组织培养中出现的污染问题，一般采用抗生素，如青霉素、链霉素、等以一定浓度加入植物培养基中，以达到抑制效果。也有采用抑菌剂，如灭菌灵、代森锰锌、等进行预处理外植体或加入到培养基中抑制细菌生长。通过考察青霉素、链霉素、土霉素和头孢噻肟钠对组培苗生长及生根的影响及其抑菌的效果，筛查到当掌叶覆盆子组培苗感染的是红色或黄色细菌时，可通过添加青霉素或链霉素来控制，提高组培苗的存活率。但从最终能生根角度考虑，建议直接向每升培养基中加入25万单位青霉素和6.25万单位链霉素（K1-1+K2-3配方）。当掌叶覆盆子组培苗感染的是乳白色细菌时，可通过添加头孢噻肟钠来控制，提高组培苗的存活率。但考虑到生根率过低，建议一旦发现掌叶覆盆子组培苗感染的是乳白色细菌，应及时将其清理。

另外对于轻度污染的组培苗，抗生素的抑制效果极为显著，三种抗生素的联合作用能有效控制掌叶覆盆子的细菌生长。但对于重度污染的组培苗，抗生素的控制效果不理想，培养1周后细菌扩散非常严重，组培苗无法生根。建议及早发现并及时处理。

*通讯作者：杨华

注释

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② 范崔生.中药采收鉴别应用全书[M].江西科学技术出版社，1995.

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