茶叶中啶虫脒残留基体标准样品的制备及测定

马 维，刘树兴，陈 琦，吴雪原，叶诚诚

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.黄山出入境检验检疫局，安徽 黄山 245000）

茶叶中啶虫脒残留基体标准样品的制备及测定

马 维1,2，刘树兴1,*，陈 琦2，吴雪原2，叶诚诚2

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.黄山出入境检验检疫局，安徽 黄山 245000）

为了获得含啶虫脒残留的茶叶基体标准物质用于分析化学实验室质量体系控制，将啶虫脒以0.05 mg/kg茶叶用量对有机成茶喷施啶虫脒药液，阴干后，磨粉，混匀获得含啶虫脒残留的茶叶基体样品。用随机抽样法对其进行均匀性检验，用直线模型法对其进行稳定性检验，并通过多个实验室联合对其定值。结果表明该样品中啶虫脒含量无显著性差异，且在-10 ℃冷冻条件下储存180 d内未观察到明显的降解趋势。实验室联合测定，确定了该样品中啶虫脒的标准值为0.041 7 mg/kg，扩展不确定度（95%置信区间）为0.004 25 mg/kg。

茶叶；啶虫脒残留；基体标准样品；制备；特性值

随着人们对食品安全意识的不断提高，以农药残留控制为核心的农产品卫生质量安全要求也越来越严格。控制农产品中农药残留量的关键环节之一是对农药残留量及时、准确的分析检测[1]。在对农药残留检测要求快速、灵敏的同时，检测结果也应具有准确性、可靠性和可比性。在建立测量结果溯源性方面，基体标准物质具有重要作用。基体标准物质的使用是对分析系统从样品到结果进行全面控制的有效方法[2]。越来越多的分析化学实验室利用基体标准物质进行质量体系控制和能力验证[3]。在我国，农药基体标准物质还十分欠缺[4]。姜海燕等[5]对白菜汁中异丙甲草胺候选标准样品的制备与定值进行了研究，余孔捷等[6-7]研制了茶叶中联苯菊酯和毒死蜱残留的自然基体标准样品，Wong等[8]研制了含有机氯的草药基体标准样品，Adel等[9]对以鱼油为天然基体材料的有机氯农药进行了制备和认证。Saldanha等[10]对以胡萝卜和土豆为基体材料的11 种在欧盟残留限量水平的农药均匀性和稳定性进行了评估。以上多位学者对农药残留基体标准物质制备技术的研究成果，促进了基体标准物质的发展。现有基体标准物质还包含无机物、营养素及产品品质特性基体标准物质等方面[11-18]，但未见加料法制备含啶虫脒茶叶基体标准物质的报道。

啶虫脒属氯化烟碱类化合物，它作为一种广谱杀虫剂于1996年由日本曹达株式会社开发并广泛使用，也成为我国茶叶生产推荐用药。我国茶叶中啶虫脒检出率极高，茶叶中的农药残留会通过茶汤进入人体[19]，进而可能对人体健康产生不利影响。开展含啶虫脒残留的茶叶标准样品的制备和定值的研究，对实验室的能力验证和监控、实验室存在问题的识别和纠正、新方法有效性和可比性的确证及日常检测工作的质量保证和质量控制具有重要意义。本实验介绍了通过加料法快速制备欧盟最大残留限量水平的啶虫脒茶叶基体标准物质，并对样品进行均匀性、稳定性检验及定值研究。经检测，所制备的样品均匀稳定，可以作为茶叶中啶虫脒残留分析用的基体标准物质使用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：有机成茶，产自安徽。

啶虫脒固体标准品（纯度98.1%，实验室A使用）德国Dr. Ehrenstorfer公司；标准品溶液：啶虫脒标准溶液（100 μg/mL，介质乙醇） 农业部环境保护科研检测所；水：GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》[20]规定的一级水；Cleanert TPT固相萃取柱（10 mL，2.0 g） 天津博纳艾杰科技有限公司；微孔过滤膜（13 mm×0.22 μm） 岛津技迩（上海）商贸有限公司；啶虫脒固体标准品（纯度99.0%，实验室B使用） 国家农药标样分技术委员会。

1.2 仪器与设备

实验室A：SFJ万能粉碎机 上海申银机械有限公司；B20-B多功能搅拌机 上海红联机械电器制造有限公司；SA320振荡器 日本Yamato公司；N-1200B旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；WAT200609固相萃取装置 美国Waters公司；AL204-IC分析天平 美国Mettler公司；DPA-20匀浆机 美国Pro公司；EBA-21离心机 德国Hettich公司；1290-6410B高效液相色谱-串联质谱仪 美国Aglient公司；ULT1386-3-V超低温冰箱美国Revoc公司。

实验室B：AUW220D分析天平 日本岛津公司；JJ-2B匀浆机 太原仪诚实验设备有限公司；TG16WS高速离心机 上虞市博盛生物科技有限公司；R-210旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；Quattro Premier高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

样品制备采用加料制备方式，在一间独立的实验室进行。取有机成茶3 kg，摊开面积4 m2，环境温度25 ℃，相对湿度80%。将啶虫脒固体标准品用乙腈溶解，配制成1 g/L的储备液，使用时用900 mL丙酮-水（2∶1）稀释成质量浓度为0.167 mg/mL的工作液，用手动喷雾器分3 轮，每轮300 mL，均匀喷施于茶叶上。喷洒时，控制喷雾器流量，使药液以细小雾状喷到摊开茶叶上，表面全部喷湿后，将茶叶聚拢，人工搅匀后再次摊开，反复多次。最后一次搅匀后，将茶叶摊开，分别于24 h和48 h后，进行第2轮、第3轮喷药。喷药完成后自然阴干（此实验环境条件下约48 h）。将干茶叶用粉碎机粉碎，过200 目筛后，全部转移到搅拌机内，以105 r/min转速搅拌10 min，混匀。将混匀后的样品分装于采样袋中，每袋100 g，密封冷冻保藏于-10 ℃冰箱中。

1.3.2 前处理方法

茶叶中啶虫脒残留的测定方法均参照GB/T 23205—2008《茶叶中448 种农药及相关化学品残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》[21]，准确称取2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈溶液，在高速组织捣碎机上以15 000 r/min匀浆提取1 min，5 000 r/min离心5 min，上清液移入鸡心瓶中，茶渣按上述方法重复提取2 次，合并3 次提取液于鸡心瓶中，45 ℃水浴，旋转浓缩至近干，加入5 mL乙腈溶解残余物。在Cleanert TPT柱中加入约2 cm高无水硫酸钠，安装在固相萃取装置上并将柱子放入下接鸡心瓶的固定架上。加样前先用5 mL乙腈-甲苯（3∶l，V/V）预洗柱。当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品提取液转移至净化柱上，并更换新鸡心瓶接收。在Cleanert TPT柱上加上50 mL贮液器，用25 mL乙腈-甲苯（3∶l，V/V）溶液洗脱农药，合并于鸡心瓶中。并在45 ℃水浴中旋转浓缩至干，1 mL乙腈溶解残渣，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱测定。

1.3.3 高效液相色谱-串联质谱测定条件

啶虫脒测定仪器条件见表1。

表1 啶虫脒高效液相色谱-串联质谱测定条件Table 1 Conditions for detection of acetamiprid by HPLC-MS/MS

两个实验室啶虫脒测定方法的回收率及精密度测定结果见表2。

表2 啶虫脒的回收率及精密度测定结果Table 1 Conditions for detection of acetamiprid by HPLC-MS/MS

1.3.4 均匀性、稳定性检验及定值方法

根据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则：（3）标准样品定值的一般原则和统计学原理》[22]的规定，对茶叶标准样品特性值进行测定。

均匀性检验：从分装前的样品中随机抽取7 个子样，其中一个子样为对比样，将对比样平行测定6 次，6 个子样进行单次测定，将测定值按数理统计的原理，进行F检验和t检验，在95%的置信度下检验样品的均匀性[23]。

稳定性检验：分别在第0、10、30、60、90、120、180天的时间点随机取样，平行测定2 份，根据测定结果进行-10 ℃冷冻条件下样品的稳定性检验。

样品定值：在茶叶通过了均匀性和稳定性检验后，将茶叶样品分送多个实验室，采用多实验室联合定值方法。选取水平相当的实验室两个，采用相同的测试方法，每个实验室发样2 份，在（至少）2 d或2 d以上进行6 次重复测量，所有的重复测量进行独立校准，报告单次测量结果和估计值及不确定度。

2 结果与分析

2.1 均匀性检验

表3 均匀性检验测定值Table 3 The content of acetamiprid residues in homogeneity test

由表3可见，对两组数据进行F检验，在显著性水平α=0.05，自由度f1=5，f2=5时查F分布临界值表，可知临界值F0.05（5,5）=5.05，用统计软件Excel计算数据的F值，计算结果F=0.977小于F临界值，说明两组数据方差齐。再进行方差齐性的t检验，在在显著性水平α=0.05，自由度f=10时，查t分布临界值表得t（0.05,10）=2.228，用Excel计算数据的t值计算，所得t=0.605小于t临界值，说明两组样品啶虫脒含量测定结果无显著性差异，样品是均匀的。

2.2 稳定性检验

各个时间点测得的农药含量的平均值见表4。

表4 稳定性检验测定值Table 4 The content of acetamiprid residues in stability test

由于在此条件下，啶虫脒降解没有严格确认的动力学机理，故采用直线作为经验模型，可表示为：

式中：β0、β1为回归系数；ε为随机误差分量；X为时间；Y为茶叶样品农药质量浓度。

对于一个稳定的标准样品，β1的期望值为0。即若该条件下茶叶中各农药含量稳定，则该模型中的截距等于测定值，而斜率趋近于零。斜率的估计值按下式计算：

截距：

β1的标准偏差s：

式中：

若|β1|＜t（0.95,n-2）×s（β1），说明斜率不显著。查表得，P=0.95，自由度n-2=5时，t-因子等于2.571，计算结果见表5。|β1|小于t（0.95,5）×s（β1），表明啶虫脒在-10 ℃冷冻条件下存放180 d内无明显的降解趋势，未观测到不稳定性。

表5 稳定性检验结果Table 5 Results of stability test

2.3 样品定值

参与联合定值的两个实验室的检测结果见表6。

用格拉布斯法对两个实验室测得数据的有效性进行判断，计算各组数据的Gi值：

式中：i为可疑值的排列序号；Xi为可疑值。

把计算值Gi与格拉布斯表给出的临界值GP（n）比较，如果计算的Gi值大于表中的临界值GP（n），则能判断该测定数据是异常值，可以剔除。在P=0.95，n=6时，查格拉布斯表获得临界值：G0.95（6）=1.882。数据的Gi值见表7，各组数据的Gi值均小于临界值，表明数据全部有效。

表6 实验室联合测定数据Table 6 The content of acetamiprid residues for joint certification inmultiple laboratories

表7 格拉布斯检验结果表Table 7 The results of grubbs test

定值结果由标准值和不确定度组成。忽略由样品均匀性和稳定性引入的不确定度，仅考虑测定方法带来的不确定度[24]。本实验测定过程中的不确定度主要来源于4 个部分。校准过程引入的不确定度（Urel（c））包括有证标准品、标准储备溶液和标准溶液稀释产生的不确定度，其对应值为3.64%；体积引入的不确定度（Urel（V））主要包括定容、移液枪和温度对体积产生的影响，对应值为0.982%；1290-6410B液相色谱串联质谱仪稳定性引入的不确定度（Urel（LC-MS））为2.08%；测定过程随机效应导致的不确定度为2.60%。

合成不确定度为：

扩展不确定度取包含因子k=2，包含概率为95%，则扩展不确定度为：

为了保证参加定值的实验室测量数据的可靠性，对两个实验室进行比对[25]，计算两个实验室测量结果的比率值Eni：

式中：yi为第i个参加实验室测量值；yR为实验室测量参考值；N为参加实验室数目；UL为参加实验室报告的测量结果的扩展不确定度（包含概率95%）。

两个实验室工作的准确度水平大致相同，测量结果不确定度大致相同，因此测量结果的参考值采用两个实验室测量值的算数平均值，且U1U2=UL。测量结果和Eni值见表8。

表8 实验室测量结果和Eni数Table 8 Results of two laboratories and Eni

两个实验室测量结果比率值|Eni|＜0.7，说明测量结果满足判据要求，实验室联合定值结果见表9。实验室联合测定，确定了该样品中啶虫脒的标准值为0.041 7 mg/kg，扩展不确定度（95%置信区间）为0.004 25 mg/kg。

表9 茶叶标准样品定值结果Table 9 Certified value of acetamiprid content in tea reference material

3 结 论

通过在有机成茶中喷洒一定量的啶虫脒，阴干后，粉碎、混匀，得到含啶虫脒残留的茶叶基体材料，密封存储于低温环境下。通过均匀性、稳定性检验及实验室联合定值的结果表明：所制备的茶叶基体材料中啶虫脒含量接近欧盟最大残留限量水平（0.05 mg/kg），样品均匀且性质稳定，可以作为茶叶中啶虫脒残留分析的基体标准物质使用。

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Preparation and Characterization of Matrix Reference Material for the Determination of Acetamiprid Residues in Tea

MA Wei1,2, LIU Shuxing1,*, CHEN Qi2, WU Xueyuan2, YE Chengcheng2
(1. School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China; 2. Huangshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huangshan 245000, China)

This study aimed to obtain tea matrix reference material containing acetamiprid residues to be used for quality system control of analytical chemistry laboratory, Acetamiprid solutions were sprayed on organic tea at a dosage of 0.05 mg/kg. After being dried in the shade, milled and mixed, tea matrix sample containing acetamiprid residues was obtained. The homogeneity was tested by random sampling method and the stability was examined by linear model method. The certification was finally carried out by multiple laboratories. The results showed that the contents of acetamiprid were not significantly different in these samples and no significant degradation was observed within 180 days at -10 ℃. The certification results showed that the standard value of acetamiprid content of tea reference material was 0.0417 mg/kg and the expanded uncertainty (95% confidence interval) was 0.004 25 mg/kg.

tea; acetamiprid residues; matrix reference material; preparation; property value

10.7506/spkx1002-6630-201602032

TS207.7

A

1002-6630（2016）02-0182-05

马维, 刘树兴, 陈琦, 等. 茶叶中啶虫脒残留基体标准样品的制备及测定[J]. 食品科学, 2016, 37(2): 182-186. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602032. http://www.spkx.net.cn

MA Wei, LIU Shuxing, CHEN Qi, et al. Preparation and characterization of matrix reference material for the determination of acetamiprid residues in tea[J]. Food Science, 2016, 37(2): 182-186. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602032. http://www.spkx.net.cn

2015-03-18

国家质检总局科技计划项目（2014IK138）

马维（1991—），女，硕士研究生，主要从事食品加工与食品安全研究。E-mail：maweiwei71@live.com

*通信作者：刘树兴（1962—），男，教授，硕士，主要从事食品加工与食品添加剂应用研究。E-mail：liusx@sust.edu.cn