CyclinD1、p16INK4在低度恶性子宫内膜间质肉瘤中的表达

2016-11-15范钦和唐正华

实用临床医药杂志 2016年19期

强　贤, 范钦和, 唐正华, 张　琪

(1. 南京医科大学第一附属医院病理科, 江苏南京, 210029;2. 南京医科大学附属常州妇幼保健院病理科, 江苏常州, 213003;3. 南京医科大学附属无锡妇幼保健院病理科, 江苏无锡, 214002)

强贤1, 2, 范钦和1, 唐正华2, 张琪3

目的探讨低度恶性子宫内膜间质肉瘤(LGESS)组织中CyclinD1、p16INK4的表达。方法采用免疫组织化学法检测36例手术切除后经病理确诊的LGESS瘤组织中CyclinD1和p16INK4蛋白的表达，分析它们与临床病理特征和预后的关系。结果CyclinD1、p16在LGESS中的表达率分别为47%、39%, 且它们的表达与患者的年龄、是否绝经、孕产次、肿瘤大小、肌层浸润深度、是否脉管侵犯、有无淋巴结转移均无相关性，但CyclinD1与临床手术病理分期及LGESS预后有关(P<0.05)。结论CyclinD1阳性表达的低度恶性子宫内膜间质肉瘤与肿瘤侵袭性的临床行为有关。

低度恶性子宫内膜间质肉瘤; CyclinD1; p16INK4; 免疫组织化学; 预后

子宫内膜间质肿瘤是少见的起源于子宫的间叶性肿瘤，约占女性恶性肿瘤的0.2%[1]，其中低度恶性子宫内膜间质肉瘤表现为具有低度恶性潜能的临床过程，预后相对较好，少有复发和远处转移。但仍有大量文献[2]证实许多低度恶性子宫内膜间质肉瘤患者在手术切除后发生复发转移或死亡。虽然大多数低度恶性子宫内膜间质肉瘤患者确诊后经过手术治疗，临床分期为I期，即肿瘤局限于子宫内，未侵及周围组织，但几年后有1/3的患者出现盆腔内复发或远处器官转移。有文献报道CyclinD1、p16INK4表达的低度恶性子宫内膜间质肉瘤是一种新的亚型，代表该肿瘤的生物学行为更具侵袭性[3]。作者通过检测CyclinD1、p16INK4在低度恶性子宫内膜间质肉瘤中的表达，分析其与肿瘤临床病理因素及预后的关系，探讨CyclinD1、p16INK4表达在低度恶性子宫内膜间质肉瘤的预后评估中的意义，报告如下。

1　材料与方法

1.1临床资料

选取南京医科大学附属常州妇幼保健院23例及无锡市妇幼保健院13例低度恶性子宫内膜间质肉瘤组织标本，均具有详细生存期跟踪随访资料，标本为2003年7月—2013年6月手术切除后病理证实为低度恶性子宫内膜间质肉瘤的存档蜡块。诊断由2位病理医生重新阅片完成，诊断结果一致。36例患者，发病年龄 35～61岁，平均45岁，因不规则阴道出血或月经改变作为首发症状，其余则因体检发现。所有患者均在诊断后行全子宫、双附件切除及盆腔淋巴结清扫手术，术前未行其他治疗，包括激素治疗及放化疗。手术病理分期：I期(未侵出子宫体)25例，II期(累及宫旁或附件)10例，Ⅲ期(累及腹腔或淋巴结有转移)1例。有淋巴结转移的病例为1例，其余均无淋巴结转移。见表1。

1.2主要试剂

鼠抗人CyclinD1、p16INK4单克隆抗体购自北京中杉金桥公司。

1.3免疫组化染色和判定标准

在美国罗氏公司BenchMarkXT全自动免疫组织化学染色机上进行。操作步骤均严格按照罗氏诊断优化程序进行。基本过程如下: 4 μm切片脱蜡, 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活动，抗原修复，滴加10%正常山羊血清封闭非特异染色后，顺序加一抗、二抗室温静置1 h后, DAB染色，苏木精对比染色，常规脱水、透明、封片，光镜下观察结果。选择已知阳性染色的切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。由2位医生独立判定结果。染色结果判定: CyclinD1以大于5%的肿瘤细胞核内棕黄色颗粒判定为阳性染色[4]。p16INK4以肿瘤细胞核内出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数大于10%为阳性，小于10%为阴性[5]。

表1　36例患者临床病理特征[n(%)]

2　结　果

2.1CyclinD1、p16INK4在低度恶性子宫内膜

间质肉瘤中的表达

CyclinD1、p16INK4在子宫内膜间质肉瘤中的阳性表达率分别为47%(17/36)，39%(14/36)，其中5例CyclinD1弥漫强表达，3例p16弥漫表达，阳性细胞数达60%以上，其余阳性细胞数为5～20%，多表达在血管周围的肿瘤细胞。3例较早复发的病例均示CyclinD1弥漫强表达。

2.2CyclinD1、p16INK4与临床病理学特征的

关系

患者的年龄、是否绝经、孕产次、肿瘤大小、肌层浸润深度、是否脉管侵犯、有无淋巴结转移与CyclinD1、p16INK4的表达均无明显差异。但CyclinD1的表达与临床手术病理分期有关, 5例CyclinD1弥漫阳性表达的病例中，3例为Ⅱ期，1例为Ⅲ期，1例为Ⅰ期。而p16INK4与之无关。见表2。

表2　CyclinD1、p16与分期的关系

2.3CyclinD1与p16INK4表达的关系

本研究36例子宫内膜间质肉瘤标本中，17例CyclinD1表达阳性，其中12例p16同时表达阳性，而22例p16表达阴性中，17例CyclinD1表达阴性。二者表达呈正相关性。

2.4CyclinD1、p16INK4与预后的关系

全部病例获得随访，时间为60个月。本组36例患者中，15例复发，复发率为41.7%，复发时间为 4～60个月，中位复发时间29个月，最早复发的3例分别是手术后4个月、7个月、11个月，其余患者均在初治后1年半以上复发。复发部位均在盆腔内(包括盆腔淋巴结转移)，无死亡病例。复发后行手术切除，辅助放化疗，目前情况良好。

15例复发转移病例中，12例示CyclinD1表达阳性，3例示CyclinD1表达阴性，提示CyclinD1与复发有相关性。p16与复发转移无相关性。12例两者共同表达的病例中，6例发生复发转移。见表3。

表3　CyclinD1、p16与预后的关系

3　讨　论

传统上，将ESS分为低级别子宫内膜间质肉瘤(LGESS)和高级别子宫内膜间质肉瘤(HGESS), 而2003版WHO分类认为HGESS缺乏特异性分化，并且组织学不同于子宫内膜间质，故将其命名为未分化肉瘤。Shuichi K等[6]将ESS分为3组进行研究，即低级别子宫内膜间质肉瘤(LGESS), 不伴核多形的未分化子宫内膜肉瘤(UES-U)和伴有核多形的未分化子宫内膜肉瘤(UES-P), 主要依据肿瘤细胞是否出现明显的不典型性及多形性、肿瘤性坏死为基础。但是，近来认为只有LGESS才是子宫内膜间质肉瘤，包括传统意义的LGESS和大部分的UES-U, 因为有研究[7]认为这两者具有相同的分子免疫表型。而HGESS被认为是未分化的子宫肉瘤即UES-P, 因为它无论从肿瘤细胞的形态学或分子生物学均不显示子宫内膜间质的分化证据，且无激素受体的表达。而本文诊断的LGESS均在一定程度上显示子宫内膜间质分化的特点，肿瘤细胞类似正常子宫内膜间质细胞，细胞大小形态较一致，无明显核异型或伴有轻-中度异型，常见肿瘤细胞围绕螺旋小动脉样结构呈漩涡状生长，部分病例局灶区域出现明显核异型，核增大，染色质增多，可见小核仁，但核大小相对一致。核分裂相多小于4个/10HPF, 个别病例核分裂相>10个/10HPF。肿瘤细胞呈巢状或岛状增生，不规则状浸润子宫肌壁间。其中1例灶区可见肿瘤性坏死，有轻到中度异型性，但肿瘤细胞具有一致性，能找到螺旋小动脉样结构，免疫组化显示激素受体阳性，CD10阳性或局灶阳性。但UES-P和瘤细胞呈现重度异型的那部分UES-U仍划分到HGESS中。因此，可能会将之前诊断为HGESS的一部分病例纳入作者诊断的LGESS中。

本研究结果显示, CyclinD1、p16在LGESS中的表达率分别为47%、39%，且它们的表达与患者的年龄、是否绝经、孕产次、肿瘤大小、肌层浸润深度、是否脉管侵犯、有无淋巴结转移均无相关性，但CyclinD1表达与LGESS临床手术病理分期和预后有关，而p16与手术分期和预后无关。提示CyclinD1会使肿瘤细胞的生长能力发生改变。进一步分析他们与预后的关系发现CyclinD1与预后不良有关，容易发生复发，因此CyclinD1可以作为潜在的生物学标志物，成为LGESS预后评估与指导治疗的重要指标。通常作者认为淋巴结转移提示预后不好，但CyclinD1的表达与预后有关，却与淋巴结转移无关，这可能与作者收集的病例有关，收集的病例中发生淋巴结转移的只有1例，且这1例显示CyclinD1、p16阳性表达。Shuichi K[8]研究结果显示CyclinD1在LGESS中表达率只有5%，在UES-U中表达率高达85%，这可能与LGESS诊断标准不一样有关。本文p16表达率与Park JY[9]的研究结果一致，并且病例选择标准一致，均显示p16与预后无关。

CyclinD1和p16均属于G1周期重要调节蛋白，研究[10]表明, CyclinD1是一种癌基因产物，在不同组织起源的多种肿瘤中过度表达，促进肿瘤细胞增殖。而p16则为一种抑癌基因，有抑制细胞增殖的作用。认为两者均阳性表达的肿瘤中，其导致肿瘤发生的原因可能与CyclinD1蛋白表达超过p16蛋白的生物效应而使Rb蛋白处于持久磷酸化状态有关，从而使Rb蛋白对细胞生长的抑制效应失活。本研究结果显示两者的表达具有相关性，可能是CyclinD1表达的明显增加促使与之相拮抗的p16表达增加。但两者共同表达的病例中，仅有6例发生复发转移，提示p16可能削弱CyclinD1的作用，而CyclinD1的单独作用与预后关系更大。近来，关于CyclinD1在子宫内膜间质肉瘤中表达已有报道，尤其在UES-U中呈现高表达。有报道[11]显示CyclinD1是伴YWHAE-FAM22基因重排子宫内膜间质肉瘤的一种诊断性免疫标记物，而伴YWHAE-FAM22基因重排的子宫内膜间质肉瘤是一种预后较差的肿瘤亚型。而Bharat R报道了CyclinD1和p16阳性表达的子宫内膜间质肉瘤，认为它是一个新的亚型，更具有侵袭性和不良预后，指出在低级别子宫内膜间质肉瘤中CyclinD1和p16阳性表达与侵袭性临床行为有密切关系。p16也常表达在UES中，提示肿瘤更具侵袭行为[12]。这与作者的实验结果一致。CyclinD1在UES-P中几乎不表达，因此认为UES-P不属于子宫内膜间质肉瘤，而应归为子宫未分化肉瘤。所以认为将CyclinD1也作为鉴别子宫内膜间质肉瘤及未分化肉瘤的重要免疫指标。

[1]Nam J H. Surgical treatment of uterine sarcoma[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2011, 25(6): 751-60.

[2]Park J Y, Kim D Y, Kim JH, et al. The impact of tumor correlation during surgery on the outcomes of patients with apparently early low-grade endometrial stromal sarcoma of the uterus[J]. Ann Surg Oncol, 2011, 18(12): 3453-61.

[3]Rekhi B1, Motghare P. Cyclin D1 and p16INK4 positive endometrial stromal sarcoma: a case report with new insights[J]. Indian J Pathol Microbiol, 2014, 57(4): 606-8.

[4]Saito T1, Oda Y, Tanaka K, et al. beta-catenin nuclear expression correlates with cyclin D1 overexpression in sporadic desmoid tumours[J]. J Pathol, 2001, 195(2): 222-8.

[5]Park J Y1, Kim K R, Nam J H. Immunohistochemical analysis for therapeutic targets and prognostic markers in low-grade endometrial stromal sarcoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(1): 81-9.

[6]Popiolek D1, Yee H, Levine P. MIB1 as a possible predictor of recurrence in low-grade endometrial stromal sarcoma of the uterus[J]. Gynecol Oncol, 2003, 90(2): 353-7.

[7]Kurihara S1, Oda Y, Ohishi Y, et al. Endometrial stromal sarcomas and related high-grade sarcomas: immunohistochemical and molecular genetic study of 31 cases[J]. Am J Surg Pathol, 2008, 32(8): 1228-38.

[8] Kurihara S1, Oda Y, Ohishi Y, et al. Coincident expression of beta-catenin and cyclin D1 in endometrial stromal tumors and related high-grade sarcomas[J]. Mod Pathol, 2010, 23(2): 225-34.

[9]Park J Y1, Kim K R, Nam J H. Immunohistochemical analysis for therapeutic targets and prognostic markers in low-grade endometrial stromal sarcoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(1): 81-9.

[10]Ewen M E1, Lamb J. The activities of cyclin D1 that drive tumorigenesis[J]. Trends Mol Med, 2004, 10(4): 158-62.

[11]Lee C H1, Ali R H, Rouzbahman M, et al. Cyclin D1 as a diagnostic immunomarker for endometrial stromal sarcoma with YWHAE-FAM22 rearrangement[J]. Am J Surg Pathol, 2012, 36(10): 1562-70.

[12]Ivy Chew, Esther O. Endometrial Stromal Sarcomas: A Review of potential prognostic factors[J]. Adv Anat Pathol, 2010, 17(2): 113-121.

Expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in low-gradeendometrial stromal sarcoma

QIANG Xian1, 2, FAN Qinhe1, TANG Zhenghua2, ZHANG Qi3

(1.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029; 2.DepartmentofPathology,ChangzhouMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003; 3.DepartmentofPathology,WuxiMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi,Jiangsu, 214002)

ObjectiveTo explore the expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in low-grade endometrial stromal sarcoma tissues. MethodsThe expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in 36 cases of LGESS was detected by immunohistochemical method. The correlations between the two proteins, clinicopathological factors and the prognosis were analyzed. ResultsExpression rates of CyclinD1, p16INK4 proteins in LGESS were 47%, 39% respectively, and there were no significant correlations between the expression of the two proteins and age, menopause, parity, tumor size, depth of myometrial invasion, lymphovascular space invasion and lymph node metastasis. CyclinD1 protein expression was associated with FIGO stage and the prognosis of LGESS (P<0.05). ConclusionThe positive expression of CyclinD1 in LGESS might be associated with clinical aggressive behavior of tumor.

low-grade endometrial stromal sarcoma; CyclinD1; p16INK4; immunohistochemical method; prognosis

2016-06-05

范钦和, E-mail: fanqinhe@aliyun.com

R 737.33

1672-2353(2016)19-061-04DOI: 10.7619/jcmp.201619018