恩度联合奥沙利铂对裸鼠胃癌种植瘤的抑制作用研究

庞凌坤，蒋志庆，田小林

(1.桂林医学院第二附属医院胃肠外科;2.桂林医学院附属医院胃肠外科,广西 桂林　541000)



恩度联合奥沙利铂对裸鼠胃癌种植瘤的抑制作用研究

庞凌坤1，蒋志庆2，田小林1

(1.桂林医学院第二附属医院胃肠外科;2.桂林医学院附属医院胃肠外科,广西 桂林541000)

目的：探讨恩度联合奥沙利铂对裸鼠胃癌种植瘤的抑制作用。方法：将人胃癌细胞SGC-7901注射于裸鼠腋下皮下，裸鼠腋下均出现瘤块即造模成功。将成模裸鼠32只随机分空白组、奥沙利铂组、恩度组和恩度+奥沙利铂组，每组各8只。给药方式均为腹腔注射，持续给药14 d。给药期间，每72 h称重1次，游标卡尺测量肿块的最长径、最短径，计算肿瘤相对体积。用药完成后，处死裸鼠，取瘤组织，称瘤重用于计算抑瘤率。对肿瘤组织和可疑淋巴结进行免疫组织化学染色，检测血管内皮生长因子(VEGF-C)的表达，并应用podoplanin蛋白作为淋巴管标记物，计算各组淋巴结转移阳性率及微淋巴管密度(LVD)。结果：恩度和奥沙利铂均能抑制肿瘤生长，但两者联合应用的效果优于单独应用；使用恩度组的淋巴转移阳性率、转移淋巴结数目及LVD均明显低于空白组与奥沙利铂组，差异具有统计学意义(P<0.01)；奥沙利铂组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)；恩度组和奥沙利铂+恩度组VEGF-C表达的光密度值显著低于空白组和奥沙利铂组(P<0.01)。结论：恩度联用奥沙利铂明显抑制裸鼠皮下种植肿瘤的生长和淋巴结的转移，产生了协同抗肿瘤作用。

胃癌;恩度;奥沙利铂;淋巴转移

肿瘤细胞生长和正常细胞生长一样，需要血液提供营养物质和氧气，但是恶性肿瘤能产生某些物质，促进肿瘤组织产生多于正常组织的新生血管，从而使肿瘤组织生长失控。因此，控制肿瘤血管生长是一种有效的治疗肿瘤的手段[1-2]。单独应用恩度或联合其他药物抑制肿瘤血管新生的研究已取得很多成果[3-4]，但恩度联合奥沙利铂对肿瘤淋巴管的生成能否起到抑制作用，相关报道仍少见。本研究探讨恩度联合奥沙利铂对裸鼠胃癌种植瘤的抑制作用，现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及材料

人胃癌SGC-7901细胞株为桂林医学院分子实验室馈赠，在37℃恒温培养箱中培育繁殖。培养基购于美国Hyclone公司，培养液加入浓度为100 μg/mL的青霉素及链霉素和5%胎牛血清。BALB/C裸鼠32只，购于湖南斯莱克景达试验动物有限公司。鼠龄4～6周，体重20～22 g，雌性，均在桂林医学院实验动物中心SPF级屏障系统内饲养，垫料、饲料及饮用水均经高压高温消毒。恩度(国药准字S200S0088)购于山东先声麦得津生物制药有限公司。奥沙利铂购于山东齐鲁制药有限公司。鼠抗Podoplanin Protein/gp36试剂盒购于Novus公司。

1.2建立模型

将对数期贴壁生长良好的人胃癌SGC-7901细胞制备成浓度为1×107个/mL的细胞悬液，于裸鼠腋下皮下注入0.2 mL。注射后局部出现明显皮丘，7 d后，32只裸鼠腋下均出现瘤块，造模成功。

1.3分组与给药

接种后11 d将成模裸鼠随机分为4组(n=8)：空白组，生理盐水0.2 mL，每24 h1次，奥沙利铂组，5 mg/kg只，每48 h1次；恩度组，恩度3 mg/kg，每24 h1次；恩度+奥沙利铂组，恩度3 mg/kg，每24 h1次，奥沙利铂5 mg/kg，每48 h1次。给药方式均为腹腔注射，持续给药14 d。

1.4观察指标

每24 h观察裸鼠的日常活动、饮食和排便等。每72 h称重一次，用游标卡尺测量肿块的最长径、最短径。计算相对肿瘤体积(RTV)。根据用药前后体积的差异来评价各组药物对肿瘤生长的抑制作用。用药完成后处死裸鼠，剥离肿瘤组织称重。可疑转移淋巴结进行免疫组织化学染色，淋巴管的标记采用淋巴内皮标记物podoplanin单克隆抗体进行免疫组织化学染色。光镜下观察，淋巴管内皮细胞podoplanin染色阳性，细胞膜、细胞质呈棕黄色或棕褐色，任何被染成棕黄或棕褐色的、分界清楚的内皮细胞或内皮细胞团簇，均作为一个淋巴管计数。淋巴管密度计数标准：先在低倍光镜(×100)下全面观察切片，确定淋巴管密度(LVD)最高处，再于高倍光镜下(×200)计数podoplanin阳性的淋巴管数目。应用多功能病理图像分析仪计数每个标本4个视野内的淋巴管数，其总值即为该标本的LVD。采用德国LEICA公司病理图像分析仪进行图像分析，测定其阳性反应产物的平均光密度值。阳性细胞为胞浆呈棕色或棕褐色的组织细胞，取其平均值作为VEGF-C蛋白表达的相对含量。

1.5统计学分析

2　结果

2.1治疗后各组移植瘤质量及相应抑瘤率比较

用药组的瘤重均小于空白组，其中联合用药组的瘤重最小；用药组中，恩度组与奥沙利铂组的抑瘤率无明显差异(P>0.05)；联合用药组的抑瘤率显著高于单一用药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

表1　治疗后各组移植瘤重量及相应抑瘤率(n=8)

*P<0.05，与奥沙利铂组、恩度组比较。

2.2各组移植瘤生长曲线比较

各给药组的皮下移植瘤生长速度均低于空白组。恩度与奥沙利铂联合后抑制肿瘤生长的效果明显优于两者单独使用。见图2。

2.3各组淋巴结转移数、转移阳性率及LVD比较 移植瘤生长天数(d) 移植瘤体积(cm3)

恩度组与奥沙利铂+恩度组的淋巴转移阳性率、转移淋巴结数目及LVD显著低于空白组与奥沙利铂组，差异具有统计学意义(P<0.01)；奥沙利铂组与空白组之间，恩度组与奥沙利铂+恩度组之间，各数值差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。见图3和表2。

表2　各组淋巴结转移数、阳性率及LVD(n=8)

组别淋巴结转移数/枚阳性率/%LVD空白3.40±0.551.00±0.019.29±0.19奥沙利铂3.50±1.490.98±0.019.16±0.39恩度0.41±0.92*0.44±0.01*4.43±0.30*恩度+奥沙利铂0.39±0.47*0.43±0.01*4.54±0.28*

*P<0.01，恩度组与空白组、奥沙利铂组比较。

2.4各组移植瘤VEGF-C光密度值比较

空白组、奥沙利铂组、恩度组和奥沙利铂+恩度组的光密度值分别为0.87±0.10，0.85±0.14，0.45±0.09和0.39±0.13。VEGF-C蛋白阳性染色见于细胞浆内，呈棕色或棕褐色颗粒状。空白组和奥沙利铂组阳性表达分布广泛，染色较强；恩度组和奥沙利铂+恩度组的阳性表达明显受到抑制，阳性染色细胞数目减少。恩度组与空白组、奥沙利铂组之间差异有统计学意义(P<0.01)；奥沙利铂+恩度组与空白组、奥沙利铂之间差异有统计学意义(P<0.01)。

3　讨论

肿瘤组织主要通过微血管的形成来营养汲取。因此，减少肿瘤内部血管生成可以成功抑制肿瘤组织生长甚至消灭肿瘤细胞。随着研究不断深入，内源性血管生成抑制因子相继被发现[5-6]。内皮抑素(ES)抑制肿瘤血管新生的效果最为显著[7]。ES是从小鼠血管内皮细胞瘤的体外培养液中提取出的一种蛋白，分子大小为20 KD，由184个氨基酸片段构成。改进研发的重组人血管内皮抑素(恩度，YH-16)相比于传统血管内皮抑素在稳定性和生物活性方面明显加强，同时保持了ES耐药性低，不良反应少等优点[8-9]。淋巴转移是胃癌转移主要方式之一，是造成胃癌患者高死亡率的最主要原因[10]。多数胃癌患者确诊前淋巴结已经转移[11]。早期，人们认为肿瘤的淋巴转移主要通过原发灶周围既有的淋巴管实现，近年，研究发现肿瘤组织自身能够促进淋巴管的新生从而实现淋巴转移[12-14]。本研究中，恩度联合奥沙利铂对人胃癌SGC-7901裸鼠模型进行药物干扰，探讨其对淋巴管新生的抑制作用。由于裸鼠自身的特异性，能够最大程度降低自身免疫系统对受试药物的干扰，且造模成功率高，效果明显。

本研究证实，恩度与奥沙利铂都能抑制肿瘤的生长，但2者联用后的效果明显优于单独应用。奥沙利铂为第3代铂类抗肿瘤药，直接对肿瘤细胞采取化学杀伤和抑制，也能影响肿瘤组织内部血管的新生，强化恩度抗血管新生效果[15]。恩度能降低血管内皮细胞的新生及迁移能力，使肿瘤组织内部新生血管减少从而达到增加血管通透性的目的。更多的肿瘤细胞暴露在外细胞毒性药中，从而增强了奥沙利铂对肿瘤细胞的杀伤作用[16]。本研究还发现，恩度能抑制裸鼠皮下移植瘤淋巴管的新生和淋巴结的转移，奥沙利铂单独应用未发现该作用。这是因为使用恩度后肿瘤周围的淋巴管数目减少，瘤细胞侵犯淋巴管的机率也相对降低[17]，与已有的研究[18-19]结果一致。早有研究者[20]发现VEGF-C的高表达可促进肿瘤淋巴管生成及增加淋巴管的密度，从而促进淋巴的转移。本研究中使用恩度组的肿瘤细胞VEGF-C的表达明显下降，可能是恩度下调VEGF-C mRNA的转录或蛋白质翻译，进而影响VEGF-C的生成，或者恩度作用于转录和翻译过程中剪切或修饰系统使VEGF-C生成减少。可见抑制肿瘤细胞VEGF-C的表达可能是恩度抑制瘤周淋巴管生成及局部淋巴管转移的途径之一。综上所述，恩度联合奥沙利铂能明显抑制裸鼠皮下移植胃癌肿瘤生长，降低肿瘤微血管密度。此联合治疗方式在动物实验中取得了良好效果，但其最合适药物剂量、应用顺序及抗肿瘤作用的分子机制需进一步研究。

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(学术编辑：肖江卫)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn作者投稿系统：http：//noth.cbpt.cnki.net邮箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Study on endostar combined with oxaliplatin in inhibiting transplanted gastric tumors in naked mice

PANG Ling-kun1,JIANG Zhi-qing2,TIAN Xiao-lin1

(DepartmentofGastrointestinalSurgery1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity;2.TheAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,Guangxi,China)

Objective：To explore the effect of endostar combined with oxaliplatin in inhibiting transplanted gastric tumors in naked mice.Methods：Human gastric cancer cell SGC-7901 was injected under subcutaneous armpits of naked mice until tumors appeared under their armpits.A total of 32 naked mices models were successfully established and randomly divided into blank group,oxaliplatin group,endostar group and combined group of endostar plus oxaliplatin,8 cases for each group.All group were intraperitoneally injected with drugs for continuously 14 d.During drug administration,the mice were weighed once every 72 h.Vernier caliper was used to measure the maximum and minimum diameters of the lumps to calculate the relative sizes of tumors.The naked mice were sacrificed after drug administration was finished to collect the tumor tissues.Then,the tumor weight was measured to calculate tumor inhibiting rate.Immunohistochemical staining was conducted to tumor tissues and suspicious lymph nodes,and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF-C) was detected. Podoplanin protein was used as lymphatic duct marker so as to calculate the positive rate of lymph node metastasis and lymphatic microvessel density (LVD).Results：Both endostar and oxaliplatin could inhibit the development of tumors,but their combination was more superior than single use in clinical efficacy.Endostar group was markedly lower than blank group and oxaliplatin group in positive rate of lymph node metastasis,count of metastatic lymph nodes and LVD,and there were significant differences (P<0.01),but the differences between oxaliplatin group and blank group were not significant (P>0.05).The optical density of endostar group and oxaliplatin+endostar group was significantly lower than that in oxaliplatin group and blank group (P<0.01).Conclusion：Endostar combined with oxaliplatin can significantly inhibit the growth of subcutaneous transplanted tumors and the metastasis of lymph nodes in naked mice,with synergic anti-tumor effect obtained.

Gastric cancer;Endostar;Oxaliplatin;Lymph node metastasis

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.012

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(z2013476)

2016-06-18

庞凌坤(1963-)，男，副主任医师。E-mail: depanglk@126.com

时间：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.024.html

1005-3697(2016)05-0666-04

R735.2

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