极化液对内毒素血症小鼠脾脏的保护作用

惠永岗，杨宇焦，陈昌林，余庆波，马丁，万勇

(1.咸阳市中心医院麻醉科，陕西 咸阳　712000；2. 川北医学院附属医院麻醉科，四川 南充　637000)



极化液对内毒素血症小鼠脾脏的保护作用

惠永岗1，杨宇焦2，陈昌林2，余庆波2，马丁1，万勇2

(1.咸阳市中心医院麻醉科，陕西 咸阳712000；2. 川北医学院附属医院麻醉科，四川 南充637000)

目的：探讨高浓度极化液(GIK)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导内毒素血症小鼠脾脏损伤的保护作用。方法：连续3 d腹腔注射脂多糖(LPS)5 mg·kg-1·d-1，构建内毒素血症小鼠模型，运用ELISA、脾脏指数、组织病理学等方法明确GIK对内毒素血症小鼠脾脏损伤是否起保护作用。结果：与LPS组小鼠比较，GIK组小鼠脾脏中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β表达显著下调(P<0.01)，抑炎因子IL-10表达上调(P<0.01)；脾脏指数显著升高(P<0.05)；脾脏损伤明显减轻。结论：GIK对内毒素血症小鼠脾脏损伤具有保护作用。

脂多糖；内毒素血症；脾脏损伤；极化液

细菌内毒素即为脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要结构，其中类脂A是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中最稳定且具有生物活性的部分[1]。内毒素作用于机体单核巨噬细胞、淋巴细胞等多种炎症细胞膜表面的Toll样受体(toll-like receptor,TLR),激活核因子NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的信号转导通路[2]，最终导致炎症细胞释放大量的炎性物质，进而引发一系列的炎症反应。近年来研究发现，与内毒素有关的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征以及多器官功能障碍综合症是临床病人感染死亡的重要原因[3-5]。内毒素血症及其引起的感染、多器官损伤和多器官功能衰竭一直是困扰临床和重症监护的问题，内毒素血症还可导致机体促炎抗炎失衡、大量的淋巴细胞凋亡，而脾脏作为主要的外周免疫器官，内毒素血症也可导致其不同程度的损害。既往研究主要倾向于脾脏储血造血方面，近年来更关注脾脏是机体免疫-神经-内分泌网络调节中心的重要组成部分,认为脾脏具有造血、滤血、抗感染和抗肿瘤作用。有研究报道，GIK可以抑制机体促炎因子分泌，诱导抑炎因子的分泌，所以我们运用GIK对内毒素血症小鼠脾脏损伤模型进行治疗干预，为内毒素血症治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁级BALB/c小鼠共45只, 雄性(8～10周龄)，体重质量20～23 g，购于川北医学院实验动物中心。

1.2主要试剂

LPS购自Sigma公司，10%葡萄糖注射液、10%氯化钾注射液、50%葡萄糖注射液、胰岛素注射液均由附院麻醉科提供，4%多聚甲醛购自成都科龙化工、磷酸盐缓冲液购自北京中山金桥、小鼠TNF-α、IL-10酶联免疫分析试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，IL-1β酶联免疫分析试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.3实验动物模型建立

将45只清洁级BALB/c小鼠随机分为3组：正常对照组、LPS组、GIK组，每组15只。实验前各组小鼠均测体重，连续3 d LPS组和GIK组每天9∶00给予腹腔注射LPS 5 mg·kg-1·d-1，GIK组经尾静脉注射GIK10 mL/kg，每日3次，间隔8 h。正常对照组和LPS组经尾静脉注射生理盐水10 mL/kg，每日3次，间隔8 h。

1.4标本采集

行腹部正中切口暴露小鼠器官，找到小鼠脾脏，完整分离取出脾脏称取脾脏重量，剪一块脾脏组织置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h、经过梯度酒精脱水、石蜡包埋切片后HE染色观察脾脏情况。剩余脾脏组织用冰的PBS洗去血迹，滤纸吸干水分，冻存与-80 ℃保存以备匀浆做ELISA。

1.5脾脏指数的计算

根据脾脏指数=脾脏重量(g)/小鼠重量(kg)的公式，计算出脾脏指数，运用统计方法分析各组脾脏指数的变化。

1.6脾脏病理切片

将固定于4%多聚甲醛的脾脏样本，经过72 h固定后，进行脱水处理。将处理好的组织用石蜡包埋机进行包埋，石蜡冷凝后，修整蜡块，在组织切片机进行切片，切片厚度为4 μm，防脱载玻片捞片后，放置于木架上，在70 ℃的电热干燥机中烤片4～5 h，使片子上的石蜡完全融化，标本即贴于载玻片上。烤干的片子放于切片盒，密封保存于室温或4 ℃条件下。染色前，将切片放于70 ℃的电热干燥机中烤片1 h。经过脱蜡、染色后在通风橱中晾干，用中性树胶封片，在光学显微镜下选取相同部位采集、分析图片。

1.7ELISA检测各组脾脏组织中炎症因子表达

用无菌剪刀减碎脾脏组织，称取相同重量组织，用pH 7.4的PBS作为介质匀浆，匀浆充分后离心20 min(3 000转/min)。仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用；分别用不同的试剂盒检测脾脏组织中各因子的表达：步骤依次为：稀释标准品、加样、温育、洗涤、加酶、显色、终止、测定、计算等步骤。

1.8统计学分析

数据均采用SPSS 17.0软件对数据进行整理，采用χ2检验进行分析。以P<0.05有统计学意义。

2　结果

2.1GIK对内毒素血症小鼠脾脏指数的影响

与正常对照组小鼠脾脏指数相比，LPS组小鼠脾脏指数明显降低(P<0.01)；GIK组小鼠脾脏指数较正常对照组低，但是较LPS组小鼠显著升高(P<0.05)，有统计学意义，见表1、图1。

表1　各组小鼠脾脏指数情况

*P<0.05，#P<0.01，与对照组比较；△P<0.05，与LPS组比较。

*P<0.05，#P<0.01，与对照组比较；△P<0.05，与LPS组比较。

2.2HE染色观察

正常对照组小鼠脾脏肉眼观察边缘光滑清晰、有光泽、镜下观察可见脾脏无充血、脾脏实质中有散在的白髓、白髓和红髓分界清晰； LPS组小鼠脾脏肉眼观察脾脏变小、颜色发黑、无光泽、脾脏表面有脓癍、镜下观察脾脏充血、各细胞之间间隙增大、质松、白髓和红髓间隙不清楚、淤血、红髓内灶状多核细胞侵润、碎裂细胞组织； GIK组小鼠的脾脏损害程度明显比LPS组减轻，见图2。

2.3脾脏中细胞因子表达变化

LPS组和GIK组的小鼠脾脏TNF-α表达水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，GIK组小鼠的TNF-α表达水平显著低于LPS组，差异有统计学意义(P<0.01)(表2、图3)。GIK 组小鼠脾脏中IL-10表达水平显著高于对照组(P<0.01)和LPS组(P<0.05)(表2、图3)与正常对照组比较，LPS组小鼠脾脏中IL-1β的表达水平显著升高，有统计学意义(P<0.01)；GIK组小鼠脾脏中IL-1β的表达水平比LPS组显著降低，有统计学意义(P<0.01)，与正常对照组比较无统计学差异，见表2、图3。

表2　脾脏中炎症因子表达

*P<0.05，#P<0.01，□P<0.001，与正常对照组比较；△P<0.05，▲P<0.01， 与 LPS组比较。

3　讨论

在先前的实验中，我们分别给予3组小鼠不同剂量(2.5 mg·kg-1·d-1、5 mg·kg-1·d-1、7.5 mg·kg-1·d-1)的LPS，结果发现，2.5 mg·kg-1·d-1组小鼠反应较轻，脾脏损伤效果不明显；7.5 mg·kg-1·d-1组小鼠症状比较重，死亡率较高，不利于实验的开展；而5 mg·kg-1·d-1组小鼠脾脏损伤较明显，但全身症状不明显，结合其它相关文献的实验造模剂量，我们选择5 mg·kg-1·d-1的剂量来创造实验模型进行研究。

GIK的临床应用已有几十年，但对其疗效长期存在争议，近年的研究分析显示对其疗效存在争议的原因之一就是所用的GIK浓度不同[6-8]，高浓度的GIK(25%葡萄糖，80 mmol/L氯化钾，50 IU/L普通胰岛素)能很好的保护缺血心肌。而低浓度GIK可能作用不大甚至没有保护作用。近年提出的胰岛素学说：即胰岛素除了具有调节代谢外，还可以通过激活心血管内源性PI3K-Akt-eNOS信号途径，抑制缺血再灌注心肌细胞TNF-α产生，减轻缺血心肌细胞的炎症反应，直接抗凋亡，抑制促炎细胞因子，发挥抗炎作用，从而通过多种机制发挥心血管保护作用[9]。由于胰岛素具有抗凋亡的作用，葡萄糖还能为炎症缺血细胞提供能量，而且内毒素血症有大量的淋巴细胞凋亡，因此理论上GIK对内毒素血症小鼠脾脏损伤具有保护作用。本实验中，通过连续3 d腹腔注射LPS (5 mg·kg-1·d-1)建立BALB/c小鼠内毒素血症脾脏损伤模型，然后经尾静脉缓慢注射10 mL/kg的GIK(葡萄糖：200 g/L，胰岛素：60 IU/L，氯化钾：60 mmol/L)q 8 h，3 d后观察小鼠行为学、体重变化、脾脏组织病理、脾脏指数、脾脏组织中IL-1β、IL-10、TNF-α细胞因子水平，结果发现，与LPS组比较，GIK组小鼠症状明显减轻；组织病理学提示GIK组小鼠脾脏损伤明显减轻；ELISA结果提示GIK组小鼠促炎细胞因子IL-1β，TNF-α明显降低，而抑炎细胞因子IL-10明显升高。由此可以说明此浓度剂量组GIK对内毒素血症小鼠脾脏损伤有保护作用。本实验的不足之处是，没有对GIK的不同剂量进行比较，其次没有对GIK对内毒素血症的抗凋亡机制进行深入研究。其机制可能为：(1)抑制促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌和增强抗炎细胞因子IL-10的表达，从而使失控的促炎/抗炎反应趋于平衡；(2)抑制TNF-α表达，起到抗炎作用；(3)极化液中的葡糖糖使机体糖代谢平衡，为机体提供营养，使机体抵抗力增强，有利于抵抗炎症。

本研究发现内毒素血症小鼠的脾脏会受到损害，组织结构发生改变，脾脏中促炎因子表达显著上调，大量研究表明[10-11]，抗凋亡可作为脓毒症的治疗措施，其不仅能减轻免疫细胞的凋亡，同样能减少肝、肺、心肌和小肠上皮细胞的凋亡，从而减少并发症，改善脓毒症预后，提高脓毒症患者的生存率。尾静脉注射 GIK可以有效促进脾脏组织结构恢复，使促炎因子IL-1β、TNF-α的表达下调，抑炎因子IL-10表达上调。脾脏指数作为评估机体免疫能力的一个指标，可以反应机体的抵抗能力，本研究通过比较正常对照组、LPS组和GIK组3组的脾脏指数，发现LPS组小鼠的脾脏指数下降明显，GIK组小鼠的脾脏指数比LPS组明显增高，由此可见，GIK对小鼠的免疫能力有提高作用。通过ELISA法检测血中炎性因子的表达变化，我们发现GIK对机体全身血液中促炎因子的降低也有显著作用。由此可见，GIK对机体的免疫具有一定的保护作用，但具体机制还有待于进一步深入研究。

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(学术编辑：林菁艳)

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Roles of GIK on spleen in a mouse model of endotoxemia

HUI Yong-gang1,YANG Yu-jiao2,CHEN Chang-lin2,YU Qing-bo2,MA Ding1,WAN Yong2

(1.DepartmentofAnesthesiology,XianyangCentralHosptial,Xianyang712000,Shaanxi;2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To explore the protection effect of high concentration polarization(GIK) on endotoxemia mice spleen injury induced by lipopolysaccharide.Methods：Endotoxemia mice model induced by 5 mg·kg-1·d-1lipopolysaccharide injection intraperitoneally for 3 consecutive days.To apply ELISA，splenic index，histopathology to make sure if there was a protection effect of GIK on endotoxemia mice spleen injury.Results：Compared with lipopolysaccharide group，the express of pro-inflammatory cytokines TNF-α、IL-1β of GIK group was down-regulated obviously(P<0.01)，anti-inflammatory cytokine IL-10 was up-regulated(P<0.01)；the spleen index was increased notably(P<0.05)；the spleen injury was attenuated significantly.Conclusion：GIK has a protection effect on endotoxemia mice spleen injury.

Lipopolysaccharide;Endotoxemia;Spleen injury;Polarization

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.010

四川省教育厅重点项目(16ZA0238)

2015-12-25

惠永岗(1983-)，男，硕士研究生，主治医师。E-mail：609729854@qq.com

万勇，E-mail：wanyong@medmail.com.cn

时间：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.020.html

1005-3697(2016)05-0659-04

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