化痰通络方对急性脑梗死溶栓后JNK mRNA表达的影响*

杨 薇，刘 爽，樊晓靖

天津中医药大学第二附属医院，天津 300193

化痰通络方对急性脑梗死溶栓后JNK mRNA表达的影响*

杨 薇，刘 爽△，樊晓靖

天津中医药大学第二附属医院，天津 300193

目的：探讨化痰通络方对急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤后调控内质网稳态关键靶点JN Km RN A的影响。方法：将健康SD大鼠160只随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、rt-PA+化痰通络法联合组各40只。除假手术组在注射时以生理盐水0.3 m L代替栓子溶液外，其余各组按大脑中动脉栓塞（M CA O）模型制备。rt-PA组予5.67m g/kgrt-PA溶栓治疗，化痰通络法联合rt-PA组在溶栓基础上予9m L/kg中药浓煎剂灌胃治疗，2次/d。每组分别于6 h及1、3、7天4个时相各取10只大鼠采用RT-PCR检测方法，观察梗死部位脑组织JNK mRN A表达变化情况。结果：与模型组相比，rt-PA组3、7天时JNK mRN A表达量均下降（P＜0.05），rt-PA+化痰通络组4个时相JNK mRN A表达量均下降（P＜0.05）；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在第1天时JNK mRN A表达量下降（P＜0.05）。结论：化痰通络方可通过降低内质网应激后细胞凋亡性信号途径中JNK mRN A表达水平减轻应激脑神经细胞不可逆性致死，达到防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤进一步发展的目的。

缺血再灌注损伤；内质网应激；细胞凋亡；JNK mRN A；化痰通络

缺血再灌注损伤严重影响急性脑梗死溶栓治疗的临床疗效，限制溶栓疗法广泛开展。经动物模型实验证实，再灌注后大量神经细胞出现凋亡，而内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是引起凋亡的重要机制之一。究其原因，ERS持续时间过长或过强，内质网稳态若不能及时重新建立，则通过一系列信号转导启动细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡，造成更大的损害。近年来研究表明J N K(c-Jun N-terminal kinases)信号途径活化是其重要凋亡机制之一。因此减缓其诱导凋亡反应可能成为减轻急性脑梗死溶栓后缺血再灌注继发性损伤的一种潜在治疗方式。

经过多年临床实践，结合既往研究成果，我院以化痰通络立法组方且联合溶栓治疗急性脑梗死患者，能明显促进神经功能恢复，提高患者日常生活能力和生存质量［1-3］。本实验通过观察化痰通络方对急性脑梗死溶栓后大鼠梗死部位脑组织J N K m RN A表达水平的影响，初步探讨该法改善急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠160只，雌雄各半，体质量200～250g(中国医学科学院实验动物中心提供，2级)，实验动物合格证号：SCXK(京)2014-0004。按随机数字表法随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、rt-PA+化痰通络法组各40只，每组再分为6小时及1、3、7天4个时相组各10只［4］进行相关检测。

1.2 药物与试剂 化痰通络法药物组成：天麻10 g，半夏10 g，胆南星5 g，丹参30 g，川芎10 g，地龙10 g，酒大黄5 g，制成9 m L/kg浓煎剂(天津中医药大学制剂中心制备，4℃冰箱保存备用)。注射用重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA，德国勃林格殷格翰公司生产，批号：005765201304)；血栓诱导剂(长春国奥药业有限公司生产，批号：20081218)。

1.3 M CA O模型制备 模型组、rt-PA组和rt-PA+化痰通络法联合组参照张新江等［5］方法制备大脑中动脉栓塞(M CAO)模型大鼠。假手术组手术方法同模型制作，注射时以生理盐水0.3 m L代替栓子溶液。

1.4 干预方法 rt-PA组、rt-PA+化痰通络法联合组于血栓注入后3小时，将5.67 m g/kg rt-PA加入0.9%生理盐水2 m L中，一次性于20分钟内由尾静脉缓慢注入溶栓治疗。rt-PA+化痰通络组同时给予化痰通络方中药灌胃治疗，6小时组于造模成功后给予中药1次；1天组于造摸成功后及处死前2小时各给中药1次，共2次；3天组于造模成功后开始给药，每日给中药2次，持续3天，共6次；7天组于造模成功后开始给药，每日给中药2次，持续7天，共14次。均采用灌胃方法给药。其余各组采用与中药相等剂量的蒸馏水于灌服中药相同时间点灌胃。

1.5 检测指标及方法 各组大鼠断头处死，取大脑梗死组织匀浆，采用荧光定量PCR检测调控内质网应激后中凋亡途径关键靶点J N K m RN A表达水平。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 11.5统计学软件处理，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

同一组内，和6小时相比，模型组1天时相J N K m RN A表达量升高(P＜0.05)，其他各组1天时相J N K m RN A表达量均达最高，符合脑梗死发展规律。同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中J N K m RN A表达量均增高(P＜0.05)；与模型组相比，rt-PA组3天、7天时相J N K m RN A表达量均下降(P＜0.05)，rt-PA+化痰通络组4个时相J N K m RN A表达量均下降(P＜0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组1天时相时J N K m RN A表达量下降(P＜0.05)，见表1。

表1 不同时相大脑梗死组织JN K m RN A表达量(±s)

表1 不同时相大脑梗死组织JN K m RN A表达量(±s)

注：■表示同一组内和6小时相比，P＜0.05；同一时相内，*表示和假手术组相比，P＜0.05；△表示与模型组相比，P＜0.05；▲表示与rt-PA组相比，P＜0.05。

组别 只数 6 h 1 d 3 d 7 d假手术组 40 0.24±0.02 0.25±0.04 0.31±0.09 0.30±0.08模型组 40 0.83±0.05* 1.00±0.09■* 0.76±0.03* 0.73±0.07*rt-PA组 40 0.73±0.16 0.93±0.11 0.58±0.14△ 0.47±0.09△rt-PA+化痰通络组 40 0.65±0.07△ 0.73±0.12△▲ 0.52±0.17△ 0.46±0.13△

3 讨论

相关研究［6］发现，ERS作为关键因素参与了脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生，其相应凋亡机制与J N K信号通路密切相关。J N K是M APK家族的重要成员之一，因其可以调控细胞内外不同的应激反应，又叫应激激活蛋白激酶。经国内外学者研究［7-9］证实，J N K信号通路能介导多种细胞外刺激诱导的细胞凋亡的发生，在调控脑组织缺血再灌注内质网应激后神经细胞调亡中发挥重要作用。因此，调节J N K信号通路是治疗细胞凋亡引起疾病的重要靶点。Anand等［10］研究发现神经细胞中J N K通路随着p-M KK4、p-J N K和p-c-J un表达增加而被激活，进一步介导神经细胞死亡，发挥重要作用。而在脑缺血再灌注损伤模型中，抑制磷酸化J N K的表达，可有效减轻全脑缺血再灌注引起的海马区域神经细胞凋亡［11］。

脑梗死属中医学“中风病”范畴，风痰瘀阻证是缺血性中风急性期的主要证型，早期投以化痰泄浊、祛瘀通络方药切中病机［12-14］。在以往研究成果的基础上结合临床经验确立化痰通络方，该方由天麻、半夏、胆南星、丹参、川芎、地龙、酒大黄7味药组成，方中川芎为血中气药，辛散上行，丹参凉血活血，二药合用行气活血祛瘀；天麻为治风之神药；半夏、胆南星具有清热化痰通络之功；地龙清热熄风通络；酒大黄清热祛瘀泻浊。7味药合用共奏祛风化痰、清热泻浊、祛瘀通络之功效。在临床上采用化痰通络法联合溶栓治疗超早期急性脑梗死风痰瘀阻证患者，疗效满意［15］。

本研究通过RT-PCR方法检测脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织J N K m RN A表达量不同时相的变化，发现与假手术组相比，其余各组J N K m RN A表达量均较假手术组增加，说明缺血再灌注损伤导致细胞凋亡发生，而在损伤后1小时达峰值，符合脑出血再灌注损伤病理发展趋势，该结果与蔡理［16］对损伤后J N K3基因参与神经细胞凋亡及神经功能恢复的研究结果相似；与模型组相比，rt-PA+化痰通络组4个时相J N K m RN A表达量均明显下降，说明化痰通络法联合rt-PA溶栓，可通过有效减少脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中J N K m RN A的表达，调控细胞凋亡信号途径，减少神经细胞不可逆致死性，进而保护脑梗死后缺血半暗带区神经细胞，防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤的进一步发展。

随着急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤的不断深入研究，复方中药在调节内质网稳态、减少细胞凋亡中多途径、多靶点作用优势可能成为治疗急性脑梗死后缺血再灌注的新方法。

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The Influence of HuaTan TongLuo Prescription on the Expressions of JNKmRNA of the Rats with Acute Cerebral Infarction after Thrombolysis

YANG Wei，LIU Shuang△，FAN Xiaojing
The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China

Objective:To observe the effects of HuaTan TongLuo prescription on the expressions of JNK mRNA of the rats after ischemia reperfusion injury with acute cerebral infarction.Methods:All 160 rats were randomly allocated to sham operation group，the model group，rt-PA group and the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA，40 rats each group.Except sham operation group received the injection of physiological saline，0.3 mL，in place of embolus solution，other groups were prepared by middle cerebral artery occlusion （MCAO）.rt-PA group accepted thrombolytic therapy，5.67mg/kg，the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA intragastric administration of herbal concentrated decoction，9mL/kg，twice per day，on the foundation of thrombolytic therapy.Ten rats were taken out from each group and detected by RT-PCR method at the times of six hours，one day，three days and seven days，and the expressions of JNK mRNA in cerebral tissue of the infracted area were observed. Results:The expressions of JNK mRNA decreased notably at three days and seven days of rt-PA group compared with the model group（P＜0.05），JNKmRNA expressions lowered obviously at four different times in the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA（P＜0.05）；compared with rt-PA group，JNKmRNA expressions reduced obviously in the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA in one day（P＜0.05）.Conclusion: HuaTan TongLuo prescription could relieve irreversible death of brain nerve cells by decreasing JNKmRNA expressions in cellular apoptosis signal pathway after the stress of endoplasmic reticulum，therefore to achieve the goal of preventing further development of ischemia reperfusion injury after the thrombolysis of acute cerebral infarction.

ischemia reperfusion injury；the stress of endoplasmic reticulum；cellular apoptosis；JNKmRNA；HuaTan TongLuo

R255.2

A

1004-6852（2016）09-0009-03

2015-03-27

国家自然科学基金项目（编号81273942）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（编号12JCZDJC25300）。

杨薇（1989—），女，在读硕士研究生。研究方向：脑病的诊治。

△通讯作者：刘爽（1984—），女，博士学位，主治医师。研究方向：脑病的中西医结合诊治。