四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPAR-γmRNA和蛋白表达的影响*

郭 敏，潘 政，张彤哲

兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030

四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPAR-γmRNA和蛋白表达的影响*

郭 敏，潘 政△，张彤哲

兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030

目的：观察四神丸对三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonicaci d，TNBS）/乙醇灌肠所致溃疡性结肠炎（ulcerati vecolitis，U C）模型大鼠结肠黏膜PPAR-γmRN A和蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法：将Wistar大鼠60只随机分为空白组、模型组、四神丸组（5 g/kg）及柳氮磺吡啶（SA SP，0.3 g/kg）组，采用TN BS/乙醇灌肠法复制U C大鼠模型，灌胃给药后肉眼观察结肠大体形态损伤并评分，采用RT-PCR和免疫组化法检测PPAR-γm RN A和蛋白的表达。结果：模型组大鼠结肠组织黏膜层可见炎症和溃疡形成；与空白组比较，模型组大鼠结肠组织PPAR-γmRN A和蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组PPAR-γmRN A和蛋白的表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：四神丸对TN BS/乙醇法所致U C大鼠模型结肠黏膜PPAR-γmRN A和蛋白的表达有上调作用，提示四神丸治疗U C的作用机制可能与调控PPAR-γ相关信号转导途径有关。

溃疡性结肠炎；蛋白；基因；四神丸

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要局限于结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症性肠病。以腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等为主要症状，属中医“久泻”“久痢”“肠风”等范畴。因其发病机制不明，发病环节多，缠绵难愈，易癌变，治疗棘手，严重影响患者生活质量而被世界卫生组织列为现代难治疾病之一［1］。近年来，有关UC发病机制的研究以及特异性治疗药物的研发成为前沿热点。在临床中中药复方治疗UC的显著疗效已被证实，但其作用机制不明。本研究以治疗UC有显著疗效的经典方四神丸为干预药物，与西药柳氮磺吡啶对比，观察其对UC大鼠模型结肠组织过氧化物酶体增殖激活受体-γ(PPAR-γ)水平的影响，探讨四神丸治疗UC的疗效机制，为开发防治UC的中成药提供实验依据［2］。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级W i star大鼠60只，雌雄各半，体质量(180±10)g，购自甘肃中医药大学科研实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 药物试剂及仪器 2，4，6-三硝基苯磺酸(TN BS)(美国Si gm a公司提供，批号：2008-16-2)；反转录试剂盒(批号：0000007526)、PCR试剂盒(Promega Corporation，批号：108030404)、TRl zol试剂(批号：19919)和琼脂糖(批号：0000101394)均购自Invitrogen公司；SP-9001免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒和一抗PPAR-γ均购自北京博奥森生物工程开发有限公司；四神丸由甘肃中医药大学附属医院药剂室制备；柳氮磺吡啶(SASP，上海三维制药有限公司生产，批号：H 32020026，0.25 g/片)；核酸定量分析仪(美国BIO-RAD)；S1000TM型PCR仪(美国BIO-RAD)；凝胶成像仪(美国BIO-RAD)；3-16PK型通用台式高速离心机(德国)；O LYM PUS CX-212型摄像显微镜(日本)；BI-2000型医学图象分析系统(成都泰盟)。

1.3 造模方法 采用参考文献［3］TN BS/乙醇溶液灌肠法复制UC大鼠模型：Wistar大鼠60只，禁食不禁水24小时，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，将直径为2m m聚丙烯管插入大鼠肛门上段8cm后，用1m L注射器一次性将TN BS/乙醇溶液(100 m g/kg TN BS+50%的乙醇0.25 mL)注入，然后抽取一定量的空气，用同样的方法注入大鼠肠腔，并提起大鼠尾部倒立30s，以防药液外漏，造模结束后保持大鼠平躺姿势，待自然清醒，空白组大鼠用等量的生理盐水灌肠。

1.4 分组与给药 将Wistar大鼠分为空白组、模型组、四神丸组及SASP组，每组15只。除空白组外均以100 m g/kg TN BS+50%乙醇0.25 m L的混合试剂灌肠。根据体表面积换算，四神丸组给予四神丸浸膏剂5g/kg灌胃(按照临床成人用量的10倍折算)，SASP组按0.3g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 m L/kg，空白组、模型组均用等体积的生理盐水灌胃。各组均于造模后第2天开始灌胃，1次/d，连续3周。

1.5 标本制备 各组大鼠末次灌胃结束后禁食不禁水24小时，行脱颈椎法处死大鼠，取出距肛门以上8 cm处的结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用预冷的PBS液冲洗肠腔内容物，取病变最明显处结肠组织大约1 cm，其中0.5 cm迅速移至液氮中保存，剩余组织置于4%中性多聚甲醛缓冲固定液中备用。

1.6 免疫组织化学法检测PPA R-γ 蛋白表达SP法：大鼠结肠组织常规石蜡包埋进行切片，石蜡切片脱蜡至水，微波高压热修复抗原，待冷却后滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；滴加5%正常山羊血清封闭液；滴加PPAR-γ一抗(浓度1∶100)，4℃冰箱过夜；滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃孵育15分钟；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育15分钟；DAB显色；苏木素轻度复染；经乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。阴性对照：同一组片中，用PBS液替代一抗，其余步骤相同。在生物显微镜下观察并拍片，以黄色或棕黄色染色为阳性表达，测定平均光密度值(mean density)。

1.7 RT-PCR法检测PPA R-γmRNA的表达 总RN A的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RN A的浓度和纯度，达到2.0＞A260nm/A280nm＞1.8。参照逆转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA，用cDNA模板对大鼠内参β-acti n及PPAR-γ基因分别进行PCR扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，内参β-acti n引物序列为：上游引物：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′，扩增产物长度292 bp；PPAR-γ引物序列为：上游引物：5′-CTCCGTGGATCTCTCCGTAA-3′，下游引物：5′-CGACATTCAATTGCCATGAG-3′，产物长度281bp。扩增反应体系为50 μL，PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像仪上成像，采用Q uanti tyO ne图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的积分光密度(X)，用β-acti n的积分光密度(A)作为内参，计算基因的相对表达量(X/A)作为实验数据。

1.8 统计学方法 数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠黏膜损伤程度 与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜损伤严重，肉眼可见多处溃疡，黏膜显著充血水肿，肠壁变厚。经四神丸及SASP治疗后大鼠结肠黏膜损伤程度均有明显减轻，其中四神丸组大鼠黏膜仅可见轻度充血水肿，其余损伤恢复正常。四神丸、SASP组与模型组比较评分降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。四神丸组与SASP组比较，结肠组织损伤情况恢复更好，但评分差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPAR-γ蛋白表达阳性细胞平均光密度值的影响(±s)

表1 四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPAR-γ蛋白表达阳性细胞平均光密度值的影响(±s)

注：与空白组比较，*表示P＜0.01，☆表示P＜0.05；与模型组比较，★表示P＜0.01。

-1

2.2 PPA R-γ蛋白表达 空白组可见PPAR-γ蛋白大量表达；模型组PPAR-γ蛋白表达减弱，数量减少；SASP组和四神丸组PPAR-γ蛋白表达增强，数量增多。各组阳性细胞平均光密度值见表1，阳性表达结果见图1。

图1 SP法检测结肠组织中PPA R-γ的基因表达

2.3 RT-PCR半定量检测 空白组大鼠结肠黏膜PPAR-γ基因有较高水平的表达，模型组的表达水平降低(P＜0.01)，与模型组相比，四神丸组和SASP组PPAR-γ的基因表达水平升高(P＜0.01)，见图2、表2。

图2 RT-PCR法检测结肠组织中PPA R-γ的基因表达

表2 四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPA R-γ基因表达的影响(±s)

表2 四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPA R-γ基因表达的影响(±s)

注：与空白组比较，*表示P＜0.01；与模型组比较，☆表示P＜0.01。

组别 只数 剂量/（g·kg-1） PPA R-γ相对表达量空白组 15 0 0.44±0.05模型组 15 0 0.19±0.02*四神丸组 15 5 0.39±0.03☆SA SP组 15 0.3 0.41±0.05☆

3 讨论

UC是发病原因不明的炎症性肠病，现代医学认为UC的发生与感染、环境影响、精神因素、免疫因素、遗传等密切相关，尤其是肠道免疫功能紊乱被公认为是本病发生的重要机制。中医学认为本病的发生多由湿邪热毒侵及，恣食生冷、肥甘之品及郁怒思虑，情志不遂等因素所致五脏功能失调引起［4-7］。脾主运化为后天之本，泄泻的发生多因饮食、劳倦损伤脾胃，临床所见UC病程长，缠绵难愈，基于中医脾肾相关理论，“五脏所伤、穷必及肾”，所以本病发病日久，“脾虚及肾”易引起肾虚。所以从“肾虚”论治UC是重要思路。四神丸是治疗五更泻的名方，临床用于治疗UC疗效显著。

四神丸是由《普济本事方》五味子散(五味子、吴茱萸)和二神丸(补骨脂、肉豆蔻)相合而成，配伍精当，药少力专。查阅期刊文献，发现研究四神丸的报道文献有两百余篇，涉及理论探讨、临床观察、实验研究，从研究结果分析证实四神丸是治疗脾肾两虚型溃疡性结肠炎的代表方［7］。四神丸针对脾肾两虚所致UC，暖脾温肾，涩肠止泻，可谓桴鼓相应，故此方备受历代医家推崇。现代多单独或加减化裁后用于治疗UC，但其调控UC肠道免疫的分子机制鲜见报道［8］。

PPAR-γ是核激素受体家族中的配体激活受体之一，控制许多细胞内的代谢过程，属于配体诱导核受体。PPAR-γ是重要的细胞分化核转录因子，在哺乳动物的心肌、血管平滑肌以及脂肪组织中均有表达，活化后可调控多种核内靶基因的表达，具有多种生物学效应［9］。PPAR-γ具有调节炎症反应、脂肪代谢、细胞分化、免疫功能等作用，参与多种慢性免疫性疾病的发生、发展过程。尤其是PPAR-γ在炎症反应和免疫调节中的作用是近年研究的热点。PPAR-γ在肠道上皮特别是结肠的隐窝上皮明显表达［10-11］，PPAR-γ是调控众多基因表达所必需的核受体。PPAR-γ的配体噻唑烷二酮类药物对UC的治疗作用在动物模型及临床患者中均得到证实［11］。PPAR-γ调控UC的炎症反应和免疫功能的分子机制不十分清楚，目前认为PPAR-γ主要通过抑制N FκB的活化发挥其在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)中的抗炎作用。最初认识的主要功能在于调节脂肪代谢，最近的研究表明它也参与炎症的调节［12］。PPAR-γ激活后可通过与N F-kB、AP-1、STATS信号通路相互作用而调控靶基因转录［13］。有研究发现PPAR-γ在UC中结肠黏膜中的表达明显低于正常组［14］。还有实验显示T、B淋巴细胞中表达的PPAR-γm RN A、PPAR-γ及其相关配体在免疫中起重要作用［15-16］。

本研究发现，空白组大鼠结肠黏膜中PPAR-γ蛋白和基因表达均较强，模型组大鼠结肠黏膜中PPAR-γ蛋白和基因表达量降低(P＜0.01)，而SASP和四神丸组PPAR-γ蛋白和基因表达量又高于模型组(P＜0.05)。说明PPAR-γ参与了UC的发病过程，四神丸治疗UC的作用机制可能是发挥温肾健脾的整体调节作用，起到了类似PPAR-γ激动剂的效用，通过升高PPAR-γ蛋白和基因的表达，调控PPAR-γ相关信号转导，进而抑制肠黏膜免疫系统的过度激活，发挥其在UC中的抗炎作用。

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The Influence of SiShen Pills on the Expressions of PPAR-γmRNA and Protein in Colonic Mucosa of the Rats with Ulcerative Colitis

GUO Min，PAN Zheng△，ZHANG Tongzhe
Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China

Objective:To observe the effects of SiShen pills on the expressions of PPAR-γmRNA and protein in colonic mucosa of TNBS/alcohol enema-induced ulcerative colitis（UC）rats，and explore its mechanism.Methods: Sixty rats werer an domizedinto the blank group，the model group，SiShen pills group（5g/kg）and SASP group（0.3g/kg），UC rat model was replicated by TNBS/alcohol enema，gross morphological injuries of the colon were observed under the naked eyes and scored，the expressions of PPAR-γ mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunohistochemical method.Results:The inflammation and ulceration could be seen in the mucous layer of colon tissue of the rats in the model group；compared with the blank group，the expressions of PPAR-γ mRNA and protein decreased notably in the colon tissue of the rats in the model group，and the difference presented statistical meaning（P＜0.01）；compared with the model group，the expressions of PPAR-γmRNA and protein raised evidently in SiShen pills group，and the difference demonstrated statistical meaning（P＜0.01）.Conclusion:SiShen pills could up-regulate the expressions of PPAR-γ mRNA and protein in colon mucosa of UC rats，which suggests that the mechanism of SiShen pills in treating UC might be related to PPAR-γ-related signal transduction pathway regulation.

ulcerative colitis；protein；the gene；SiShen pills

R574.6

A

1004-6852（2016）09-0015-04

2016-01-29

甘肃省自然科学基金（编号1107RJZA 222）。

郭敏（1962—），男，主治医师。研究方向：急救医学。

△通讯作者：潘政（1977—），男，博士研究生，副主任医师。研究方向：危重病的教学、临床诊治与研究。