沉默Kin17表达抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖

孙振亚梁琳何洁婷王玲玲曾涛

·论著·

沉默Kin17表达抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖

孙振亚1梁琳2何洁婷2王玲玲2曾涛3，4★

目的探讨沉默Kin17表达对乳腺癌细胞生长增殖的影响，为评估该分子作为未来药物靶点的潜能提供依据。方法分别用携带Kin17基因特异性siRNA与正常对照siRNA的慢病毒重组载体感染MDA-MB-231细胞，再用嘌呤霉素进行抗性筛选，然后在荧光显微镜下观察阳性细胞的比例；用Real-time PCR与Western blot方法检测稳定转染了慢病毒重组载体的MDA-MB-231细胞中的Kin17 mRNA与蛋白表达水平；CCK-8实验检测细胞生长增殖状况。结果通过感染携带Kin17特异性siRNA的病毒重组载体，稳定、明显敲减了MDA-MB-231细胞中的Kin17mRNA与蛋白表达水平，而且显著减缓了该乳腺癌细胞的生长增殖速度。结论沉默Kin17表达能抑制三阴表型乳腺癌细胞的增殖，并有可能成为一种潜在的乳腺癌治疗新策略。

Kin17；基因沉默；乳腺癌细胞；细胞增殖；三阴型

乳腺癌是女性的头号肿瘤杀手，严重威胁着女性的生命健康［1］。早期患者进行肿瘤组织手术切除为较好的选择，而进展期的患者的放化疗效果还不是很理想。目前，分子分型及相应的靶向治疗在乳腺癌中已取得了令人振奋的疗效［2］。内分泌疗法能明显改善雌激素（estrogen receptor，ER）或孕激素受体（progestrone receptor，PR）阳性的患者的预后生存［3］。人表皮生长因子受体2（human epidermal grow th factor receptor-2，HER-2）阳性的患者对抗HER-2抗体药物的临床疗效喜人［4］。而最近发现，这些靶向药物在临床应用中也出现了较多的耐药性。特别是三阴表型（ER-PRHER-2-）的患者，暂时没有明显有效的靶向药物选择，预后极差［5］。因此，挖掘更多的药物靶点，对乳腺癌患者的有效治疗非常紧要。

Kin17是一个物种进化中十分保守的蛋白质，在细胞中主要参与DNA复制和DNA修复功能［6，7］。最近，多项研究显示，该蛋白与肝癌、结肠癌、肺癌、胶质瘤等多种肿瘤的进展及预后疗效有关［8-11］。本课题组前期研究发现，Kin17在乳腺癌组织中表达明显升高，很可能参与该肿瘤的发生发展［12］。本文将探讨沉默Kin17表达对三阴表型乳腺癌细胞MDA-MB-231生长增殖的影响，为评估该分子作为未来药物靶点的潜能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

MDA-MB-231细胞购自上海中科院细胞库，慢病毒载体GV115与siRNA购自上海吉凯基因有限公司，胎牛血清FBS、Leibovitz-15培养基和Trizol购自美国Invitrogen公司，M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司，PrimerSTAR DNA聚合酶购自大连宝生物公司，CCK-8购自于美国sigma公司，鼠抗人Kin17单抗、羊抗鼠IgG-HRP二抗购于美国Santa cruz公司，PCR引物由广州华大基因有限公司合成，其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

1.2 细胞培养

MDA-MB-231细胞用Leibovitz-15培养基（添加10％胎牛血清、100 U/m L青霉素、100mg/L链霉素）在37℃、含5％CO2的孵箱中培养。

1.3 稳定转染慢病毒重组载体的细胞株筛选

先针对Kin17基因（GenBank number NM_ 012311，1 182 bp）靶序列设计siRNA，然后分别把合成的相应Kin17_siRNA和正常对照siRNA双链DNA与慢病毒载体GV115进行定向拼接，形成重组载体GV-siRNA_Kin17与GV-siRNA_NC，经测序鉴定正确。重组病毒载体与辅助包装原件质粒用Lipofectamine 2000共转染293T细胞，转染8 h后更换为完全培养基，继续培养48 h，收集细胞上清液，然后进行慢病毒颗粒浓缩与病毒滴度测定。接着，把包装好的病毒感染MDA-MB-231细胞，用嘌呤霉素筛选，在荧光显微镜下观察携带荧光细胞的比例，当阳性感染率达到80％以上时停止抗性筛选，得到稳定转染沉默载体的细胞株MDA-MB-231KD与对照细胞株MDA-MB-231NC（图1）。

1.4 Real-time PCR

根据已知的人Kin17 cDNA序列自行设计上游引物（5′-CAACTATTGCTGGCTTCA-3′）与下游引物（5′-TGTCTCGTCCACTTTGC-3′），PCR产物片段的理论值为243 bp。GAPDH作为内参对照，上游引物（5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′）与下游引物（5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′）的理论上PCR产物片段为121 bp。收集生长状态良好的细胞，先用Trizol抽提总RNA，再用M-MLV逆转录酶把总RNA反转录而获得cDNA，接着配制PCR反应体系，混匀后稍离心，于Takara TP800实时定量PCR仪上进行扩增测定。扩增参数为：95℃预变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，共进行40个循环。

1.5 Western blot分析

收集生长状态较好的细胞，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液溶解细胞，离心取上清进行SDS-PAGE电泳分离，随后电转至PVDF膜上。PVDF膜用5％脱脂奶粉于室温封闭1 h，再加入鼠抗人Kin17单抗，GAPDH作为内参。次日，滴加羊抗鼠IgG-HRP二抗孵育45m in，经PBST漂洗后，最后用ECL底物曝光及拍照。

1.6 CCK-8细胞增殖检测

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化并收集，再用完全培养基制成细胞悬液（2×104个/m L）；按照每孔100μL种植于96孔板中，每组设置6孔重复；待细胞完全沉降下来后，在显微镜下观察各组的细胞密度与均匀程度适可后，放入细胞培养箱中培养。20 h后，加入10μL CCK-8试剂于培养板孔中，无需换液。继续培养4 h后，把96孔板置于振荡器上振荡5m in，再用酶标仪在450 nm波长下检测OD值。本实验重复3次，数值用均值±标准差表示。

1.7 统计学处理

实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，不同组细胞间的生长曲线用配对T检验来比较分析，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功筛选获得稳转慢病毒载体GV-siRNA_Kin17与GV-siRNA_NC的细胞株

分别将已构建的慢病毒重组载体GV-siRNA_Kin17与GV-siRNA_NC感染MDA-MB-231细胞，用嘌呤霉素进行抗性筛选，携带有绿色荧光载体的阳性细胞比例逐渐增加。当阳性细胞率达到80％以上（图1）及细胞汇合度达到约80％时，我们即得到了稳定转染重组病毒载体的细胞株MDA-MB-231KD与对照细胞株MDA-MB-231NC，并把它们作为下一步细胞功能研究的实验材料。

2.2 用GV-siRNA_Kin17载体有效沉默MDA-MB -231细胞的Kin17表达

Real-time PCR检测结果显示，转染了GV-siRNA_Kin17病毒载体的MDA-MB-231KD细胞中的Kin17mRNA表达水平明显下调，比正常对照细胞MDA-MB-231NC减低了77.5％（图2A）。Western blot实验结果也表明，MDA-MB-231KD细胞中的Kin17蛋白表达水平也比正常对照细胞明显下降（图2B）。这提示该病毒重组载体的基因沉默效果较好。

2.3 沉默Kin17表达对MDA-MB-231细胞增殖的影响

正常对照细胞MDA-MB-231NC的生长状态良好。而CCK-8实验显示，MDA-MB-231KD细胞的生长增殖速度比对照细胞MDA-MB-231NC要明显减缓，P=0.002 6＜0.01（图3）。

3 讨论

已有多项研究表明，Kin17是细胞中DNA复制复合物的一个重要成员，用Kin17抗体作用于细胞，会抑制细胞DNA复制水平［6］。紫外线或离子辐射细胞，能引起该分子的表达上调及定位改变［7］；它很像一个DNA维持蛋白，参与晚期的DNA修复［13］。最近研究发现，该蛋白与一些肿瘤的发生发展密切相关［8，14］。上调Kin17水平能促进肝癌细胞的生长增殖［8］。而沉默Kin17表达能促进结直肠癌细胞对常用化疗药物的敏感性［9］。

据报道，Kin17在机体各种正常组织中普遍低表达［15］。本课题组研究也显示，Kin17在乳腺正常上皮细胞Hs-578Bst与MCF-10A中表达较低，该蛋白在MCF-10A细胞受血清刺激增殖后表达升高；而且通过转染携带Kin17基因的重组质粒来上调Kin17表达水平，能明显促进MCF-10A细胞的增殖速度［16］。因此，Kin17与乳腺上皮细胞的生长增殖密切相关。我们还发现，该分子在常见乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、BT474、MCF-7、SKBr-3等）及临床乳腺癌标本组织中表达明显升高，提示其很可能在乳腺癌细胞的快速增殖及癌症转化中发挥重要作用［12］。在本研究中，通过感染携带特异性siRNA的病毒重组载体，稳定、明显敲减了MDA-MB-231细胞中的Kin17基因与蛋白表达水平，而且显著抑制了该乳腺癌细胞的生长增殖速度。因此，沉默Kin17很可能是一种潜在的乳腺癌治疗新策略。特别是对于ER-PR-HER-2-表型的患者，Kin17也许是一种潜在的有效靶点。

目前，Kin17在乳腺癌细胞增殖中的调控机制尚有待阐明［8］。我们已证实，上调Kin17表达能促进MCF-10A细胞的DNA复制活性［16］；化疗药物阿霉素能诱发MCF-10A细胞产生较多的DNA损伤，同时也引起Kin17蛋白反应性升高［12］。因此，Kin17很可能在乳腺上皮细胞加速增殖中支持其DNA复制及损伤修复功能。本前期研究还发现，上调Kin17能促进MCF-10A细胞中的ERK1/2的磷酸化活性，提示该蛋白也许参与EGFR癌症信号途径［16］。本课题组还发现，上调Kin17表达能促进MCF-10A细胞中的cyclin D1的表达水平［16］。另有学者也证实，上调Kin17能上调肝癌细胞的cyclin D1水平［8］。这充分表明了该蛋白对细胞周期中G1/S转换的调控作用。对Kin17在乳腺癌细胞中功能及其分子调控机制的深入探究，将有助于揭示乳腺癌细胞快速增殖及癌症转化的潜在机制，为乳腺癌治疗新方案的摸索提供有力的科学依据。

［1］Siegel RL，M iller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016［J］.CA：A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（1）：7-30.

［2］Kos Z，Dabbs DJ.Biomarker assessment and molecular testing for prognostication in breast cancer［J］.Histopathology，2016，68（1）：70-85.

［3］Almstedt K，Schm idt M.Targeted therapies overcoming endocrine resistance in hormone receptor-positive breast cancer［J］.Breast Care，2015，10（3）：168-172.

［4］Zanardi E，BregniG，de Braud F，etal.Better together：targeted combination therapies in breast cancer［J］. Seminars in Oncology，2015，42（6）：887-895.

［5］Collignon J，Lousberg L，Schroeder H，et al.Triplenegative breast cancer：treatment challenges and solutions［J］.Breast Cancer（Dove Med Press），2016，8：93-107.

［6］Biard DS，Miccoli L，Despras E，et al.Participation of kin17 protein in replication factories and in other DNA transactions mediated by high molecular weight nuclear complexes［J］.Molecular Cancer Research，2003，1（7）：519-531.

［7］Kannouche P，Pinon-Lataillade G，Tissier A，et al. The nuclear concentration of kin17，a mouse proteinthat binds to curved DNA，increases during cell proliferation and after UV irradiation［J］.Carcinogenesis，1998，19（5）：781-789.

［8］Kou WZ，Xu SL，Wang Y，et al.Expression of Kin17 promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo［J］.Oncology Letters，2014，8（3）：1190-1194.

［9］Yu M，Zhang Z，Yu H，etal.KIN enhances stem celllike properties to promote chemoresistance in colorectal carcinoma［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，448（1）：63-69.

［10］曾涛，陆光明.KIN17在28例肺癌标本中的表达分析［J］.检验医学与临床，2013，10（12）：1619-1620.

［11］Ramos A，Gaspar V，Kelmer S，et al.The kin17 protein in murinemelanoma cells［J］.International Journal of Molecular Sciences，2015，16（12）：27912-27920.

［12］Zeng T，Gao H，Yu P，et al.Up-regulation of kin17 is essential for proliferation of breast cancer［J］.Plos One，2011，6（9）：e25343.

［13］Masson C，Menaa F，Pinon-Lataillade G，et al.Globalgenome repair is required to activate KIN17，a UVC-responsive gene involved in DNA replication［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100（2）：616-621.

［14］曾涛，朱正，郜红艺，等.人Kin17蛋白的原核表达及纯化［J］.生物技术，2013，23（3）：28-31.

［15］Kannouche P，Mauffrey P，Pinon-Lataillade G，et al. Molecular cloning and characterization of the human KIN17 cDNA encoding a component of the UVC response that is conserved among metazoans［J］.Carcinogenesis，2000，21（9）：1701-1710.

［16］曾涛，吴坤河.Kin17表达促进乳腺上皮细胞MCF-10A增殖［J］.中国生物化学与分子生物学报，2013，29（5）：457-462.

Silencing of Kin17 inhibits proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells

SUN Zhenya1，LIANG Lin2，HE Jieting2，WANG Lingling2，ZENG Tao3，4★
（1.Department of Laboratory Medicine，Central Hospital of Longhua New District，Shenzhen，Guangdong，China，518110；2.The First Clinical Medicine College，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；3.Laboratory Medicine Center，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；4.School of Laboratory Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong，China，523808）

Objective To explore the effectof Kin17 silencing on the proliferation of breast cancer cells，and assess the potential of Kin17 asanew drug target.Methods MDA-MB-231 cells were infected with the lentiviral recombinant vectors carrying Kin17 siRNA or normal controlled siRNA，and were screened with puromycin.The rates of the positive cells were observed under a fluorescence microscope.Real-time PCR and Western blot assay were performed to detect them RNA level and protein level of Kin17 in MDA-MB-231 cells transfected with the lentiviral recombinant vectors.And the CCK-8 assay was used to test the cell proliferation. Results The infection of the lentiviral recombinant vector carrying Kin17 siRNA stably knocked down the mRNA level and protein level of Kin17，and slowed down the cell grow th significantly in MDA-MB-231 cells. Conclusion Our findings indicate that the silence of Kin17 expression could inhibit the cell proliferation of triple-negative breast cancer cells，andwould bea potential therapeutic target for breast cancer.

Kin17；Gene silence；Breast cancer cell；Cell proliferation；Triple-negative

广东省医学科学技术研究基金项目（A2013622）；广东省大学生创新创业训练计划项目（201512121118）；东莞市医疗卫生科技计划一般项目（20131051010005）；南方医科大学大学生创新创业训练计划项目（201512121245）

1.深圳市龙华新区中心医院检验科，广东，深圳518110 2.南方医科大学第一临床医学院，广东，广州510515 3.南方医科大学南方医院检验医学科，广东，广州510515 4.广东医科大学医学检验学院，广东，东莞523808

★通讯作者：曾涛，E-mail：zengt@smu.edu.cn