广西玉林特殊教育学校耳聋相关基因突变分析

李伍高严提珍★唐宁李哲涛唐向荣杨艳蔡稔李静文

·论著·

广西玉林特殊教育学校耳聋相关基因突变分析

李伍高1，2严提珍1，2★唐宁1，2李哲涛1，2唐向荣1，3杨艳3蔡稔1，2李静文1，2

目的分析广西玉林地区耳聋患者相关致病基因突变，初步了解玉林地区耳聋患者发病的分子机制。方法对玉林地区2个特殊教育学校191例耳聋患者进行分子病因信息采集，对6岁以上患者行纯音测听和声导抗进行听力评估；小于6岁的患儿行40 Hz相关电位、畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）和听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）进行听力评估。采集外周血4m L并提取基因组DNA，用耳聋基因微阵列芯片技术对4个致聋基因的9个突变位点（GJB2基因：c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT；GJB3基因：c.538C＞T；SLC26A4基因：c.919-2A＞G、c.2168A＞G；线粒体DNA 12SrRNA基因：m.1494C＞T、m.1555A＞G）进行基因突变分析。结果在28例耳聋患者中检出GJB2、SLC26A4和线粒体DNA 12SrRN A基因突变，总检出率为14.66％（28/191），其中GJB2基因c.235delC纯合突变3例，c.176_191del16和c.235delC复合杂合突变1例，c.235delC杂合突变2例，c.299_300delAT杂合突变合并SLC26A4基因c.919-2A＞G杂合突变1例；SLC26A4基因c.919-2A＞G纯合突变4例，c.919-2A＞G杂合突变13例，c.919-2A＞G和c.2168A＞G复合杂合突变2例；线粒体DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G均质突变2例。结论广西玉林地区耳聋患者热点突变基因以SLC26A4基因最为常见。玉林地区耳聋患者的相关基因检出阳性率、GJB2基因、SLC26A4基因及线粒体DNA 12SrRNA基因的携带率均低于全国平均水平。

耳聋；基因突变；微阵列芯片技术

随着现代分子生物学技术和遗传学的发展，尤其是人类基因组图谱的成功绘制和测序技术的自动化都为耳聋基因诊断提供了坚实的基础。耳聋基因诊断技术的出现和发展使诊断耳聋的方法由影像和物理检测听力水平提升至分子检测水平，为越来越多的耳聋患者（特别是儿童患者）揭示了分子病因，也为耳聋基因治疗的基础研究奠定了坚实的基础，是转化医学推动疾病防治的范例。在我国大规模的耳聋致病基因的流行病学调查数据显示，GJB2、SLC26A4和线粒体基因是导致非综合征性耳聋（non-syndromic hearing loss，NSHL）的3个最常见的致病基因，且不同地区不同人群的基因检出率差异较大［1-2］。

由于与耳聋相关的致病基因较多，而且相关的致病基因具有极高的遗传异质性，给临床选择何种基因诊断技术检测耳聋基因带来极大困难，因此如何建立一种行之有效的方法检测耳聋致病基因成为临床基因诊断首要解决的问题，基因芯片检测技术是随着基因组计划发展起来的新型的分子生物学技术，其诞生和高速发展为高通量基因突变检测带来了新的曙光［3］。中国解放军总医院与北京博奥生物技术有限公司共同研发了一款可同时检测中国人常见的4个耳聋相关基因中的9个热点突变的基因诊断芯片［4］，该技术将芯片技术和等位基因特异性引物延伸PCR相结合，可以准确快速地诊断耳聋相关致病基因，而且敏感性高，从而显示出广阔的临床应用前景。本研究利用耳聋基因诊断芯片对广西玉林地区2个特殊教育学校开展4个致聋基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA 12SrRNA）进行突变分析，为该地区耳聋家庭提供致病基因的携带状况和遗传规律等信息，为耳聋的遗传咨询、产前诊断及出生缺陷预防的临床实践提供理论基础和技术保障，促进聋病三级预防的实现。

1 对象与方法

1.1 研究对象及样本采集

以广西玉林市2个特殊教育学校的耳聋人群作为研究对象，告知并签署知情同意书后，采集该人群的相关病史，包括基本信息、出生史、耳聋发病年龄、家族史、个人史（耳聋前传染病史、耳毒性药物使用史、头部外伤史等）、母亲孕产期情况等。经全身及耳鼻咽喉科常规检查，对6岁及6岁以上患者行纯音测听和声导抗进行听力评估；小于6岁的患儿行40 Hz相关电位、畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）和听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）进行听力评估。结合病史排除其他症状和体征，191例患者被诊断为NSHL。其中男性113例，女性78例，年龄4～24岁，平均年龄（8.2±4.5）岁，所有耳聋患者抽取EDTA-Na2抗凝静脉外周血4m L。

1.2 基因组DNA提取和浓度测定

取500μL全血利用全自动磁珠法（福建厦门致善生物技术有限公司）提取外周血基因组DNA。利用ASP2680核酸测定仪（ACTGene，美国）检测提取的基因组DNA浓度和质量。DNA样本浓度需在100～200 ng/μL，A260/A280比值应在1.6～2.0，A260/A230比值需≥2.0。提取的DNA-20℃保存备用。

1.3 耳聋基因芯片检测

应用北京博奥生物技术有限公司的晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法）对4个致聋基因GJB2基因（c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299delAT），GJB3基因（c.538C＞T），SLC26A4基因（c.919-2A＞G、c.2168A＞G），线粒体DNA 12SrRNA基因（m.1494C＞T、m.1555A＞G）共9个突变位点进行检测。检测设备为美国ABI 9700PCR仪、北京博奥生物技术有限公司耳聋基因芯片检测系统：芯片扫描仪LuxScanTM10K-A及配套软件、杂交仪（BioM ixerTMII）、芯片洗干仪（SlideWasherTM8）。

2 结果

应用微阵列芯片方法，在191例耳聋患者中共有28例检测到GJB2、SLC26A4和线粒体DNA 12SrRNA基因突变，检出率为14.66％（28/191），见表1。7例样本检测出GJB2基因突变，包括c.235delC、c.299delAT和c.176del16，检出率为3.66％（7/191）。其中c.235delC突变6例，检出率为3.14％（6/191）；c.235delC纯合突变3例；c.235delC单杂合突变2例；复合杂合突变1例（基因型为c.176_191del16/c.235delC）。1例c.299delAT单杂合突变合并SLC26A4基因c.919-2A＞G单杂合突变，检出率为0.52％（1/191）。4例患者能明确病因，占总数的2.09％（4/191），未发现c.35delG突变位点。SLC26A4基因突变有20例，检出率为10.46％（20/191），其中14例为c.919-2A＞G单杂合突变（1例合并GJB2基因c.299_300delAT单杂合突变）；4例为c.919-2A＞G纯合突变；2例为复合杂合突变（基因型均为c.919-2A＞G/c.2168A＞G）。能明确病因的有6例，占总数的3.14％（6/191）。线粒体DNA 12SrRNA m.1555A＞G均质突变检出2例，男女患者各1例，检出率为1.04％（2/191）。部分阳性病例耳聋基因芯片检测图谱见图1。

表1 191例耳聋患者基因芯片检测结果Table 1 Detection DNA microarray results of 191 deafness patients

3 讨论

由耳聋相关的遗传基因突变引起的遗传性耳聋占先天性耳聋的半数以上，遗传性耳聋分为2大类，综合性耳聋和非综合性耳聋，临床上无其他器官损害及功能障碍只单一的表现为听力损失的称为非综合性耳聋，占遗传性耳聋的60％左右［5］。大多数的遗传性耳聋是单基因病，分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传及线粒体遗传，Angeli等［6］人通过建立小鼠模型发现至少64个基因与耳聋明确相关。

耳聋有众多相关基因，虽然耳聋相关的致病基因较多，而且具有较强的遗传异质性，但是大多数的耳聋患者是由少数有限的几个基因突变引起的，这为临床开展进行耳聋基因诊断和产前诊断提供了诊断依据基因。中国解放军总医院戴朴教授团队［7-9］率先在国内进行了大规模耳聋分子流行病学研究调查，其研究结果显示GJB2、SLC26A4、线粒体DNA 12SrRNA基因是中国人遗传性耳聋最常见的3个致病基因，人群携带率分别为21％、14.5％、3.4％。王国建等［10］根据流行病学调查结果开发的芯片能检测出42.41％NSHL患者。本文应用微阵列芯片方法对广西玉林地区的耳聋患者的检出阳性率为14.66％，其中GJB2基因突变3.66％，SLC26A4基因突变10.47％，线粒体DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突变1.04％，研究结果表明玉林地区耳聋患者的相关基因检出阳性率及GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体DNA 12SrRNA基因的携带率均低于全国平均水平。造成这些差异的原因可能包括：（1）相对于传统的酶切及Sanger测序等方法，微阵列芯片方法的检出率稍低，未覆盖其他位点突变。（2）中国人耳聋基因在地域上存在差异性。在戴朴教授团队的研究中，他们选择的研究对象65％以上患者来源于北方人群，南方人群仅局限在广西柳州、广东佛山等几个省市，倾向于反映北方人群耳聋分子流行病学趋势。

导致NSHL常见的病因之一GJB2基因突变，15％～33％中国人群中耳聋患者由GJB2基因突变所致，广西玉林地区仅有2.09％（4/191）的耳聋患者由GJB2异常引起，最常见的致病突变位点为c.235delC，与国内报道相同［7，11］。本文GJB2突变的NSHL患者，耳蜗神经和听觉中区完整，可通过人工耳蜗的植入恢复较好的听力。SLC26A4基因突变可导致Pendred综合征及大前庭水管扩大综合征（enlarged vestibular aqueduct synodrome，EVAS）。我国约97％的EVAS患者能够检出SLC26A4基因突变，其主要突变类型为c.919-2A＞G。本文9例大前庭水管扩大患者均携带SLC26A4基因突变，4例为c.919-2A＞G纯合突变，2例为c.919-2A＞G/c.2168A＞G复合杂合突变，3例c.919-2A＞G杂合突变。有30％携带SLC26A4基因单等位基因突变的患者会表现为大前庭水管扩大［8］，对于杂合突变患者应通过Sanger测序进一步检测SLC26A4基因其他突变位点，以明确最终的基因型。大前庭水管扩大患者内耳环境比较脆弱，如头部外伤、感冒发热等任何引起颅内压变化的因素可导致EVAS患者听力下降。本文中3例EVAS患者出生时听力筛查通过，2岁后在头部震荡、感冒后出现波动性听力下降，最后残余听力完全丧失。若能在新生儿时期进行SLC26A4基因筛查，不仅能明确病因，还可以提醒家长注意日常防护，保护残余听力，延缓患者听力下降的速度。线粒体DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突变引发的耳聋与氨基糖甙类药物使用不当有关。突变携带者对氨基糖甙类药物比较敏感。广西玉林地区NSHL患者中线粒体DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突变检出率为1.04％，低于全国平均水平（3.4％）。本文2例患者均在应用氨基糖甙类药物后致聋，这提示在使用耳毒性药物治疗儿童疾病前，要注意了解患儿耳聋的家族史，若有条件时应进行线粒体DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G和m.1494C＞T位点筛D查，避免药物性耳聋的发生。

本研究通过对广西玉林两个特殊学校耳聋人群进行耳聋基因突变分析，结果发现SLC26A4、GJB2和线粒体DNA 12SrRNA基因是该地区耳聋患者最主要的致病基因，检出率分别为10.46％、 3.66％和1.04％。部分患儿仅仅检出单等位基因杂合突变，还有将近85.34％耳聋患者未检出任何突变，原因包括：（1）部分患者可能由于环境因素（如病毒感染、噪声等）诱发耳聋；（2）这与遗传性耳聋基因微阵列芯片覆盖的基因类型和突变位点检测相关，由于芯片仅检测4个致聋基因9个突变位点，其他突变位点没有涵盖，故存在部分患者漏诊的可能；（3）部分患者可能是由于其他罕见基因发生突变而引发耳聋。因此，下一阶段我们将利用其他分子检测手段对这些耳聋患者进行进一步的基因分析。随着Illumina、SOLiD等新型测序平台的出现，短时间内完成几百万甚至更多片段的靶向序列捕获、大规模平行测序将成为现实，可实现对所有已知耳聋基因的同步检测［12-14］。这一技术性探索将以较低的成本在大规模人群中检测所有的耳聋基因，并有望在耳聋的基因诊断中开展更广泛、有效的临床应用［15-18］。随着高通量测序的普及和检测成本的下降，高通量测序是未来检测耳聋基因的必然趋势。

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Analysis of deafness-related gene mutations in hearing loss patients in Yulin special education school of Guangxi

LIWugao1，2，YAN Tizhen1，2★，TANG Ning1，2，LIZhetao1，2，TANG Xiangrong1，3，YANG Yan3，CAIRen1，2，LI Jingwen1，2
（1.Liuzhou Key Laboratory of Birth Defects Prevention and Control，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；2.Department of Medical Genetics，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；3.Hearing Diagnosis Center，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001）

Objective To identify the deafness-related gene mutations in patients with hearing loss in Yulin，and to explore the molecular pathogenic mechanism.Methods Patients’information was collected and blood samples were obtained from 191 patients with hearing loss from a special education school.Patients 6 years of age or older were evaluated by pure tone audiometry and acoustic immittance.Patients less than 6 years old were evaluated by 40 Hz auditory event related potential，distortion product otoacoustic emission（DPOAE）and auditory brainstem response（ABR）.Genomic DNA samples of 191 deafness patients were extracted from peripheral blood.9 mutations of 4 genes（including c.35delG，c.235delC，c.176del16，c.299delAT in GJB2 gene；c.538C＞T in GJB3 gene；c.919-2A＞G and c.2168A＞G in SLC26A4 gene；m.1494C＞T and m.1555A＞G in m tDNA 12SrRNA gene）were detected with the gene chip technique.Results Among 191 patients with hearing loss，28 cases were found to carry at least one pathogenic gene mutation.The positive detection rate was 14.66％（28/191）.In these patients，7 cases had GJB2 gene mutations（c.235delC homozygous mutation in 3 cases，c.176_191del16/c.235delC compound heterozygous mutation in 1 case，c.235delC heterozygous mutation in 2 cases，c.299_300delAT/c.919-2A＞G compound heterozygous mutation in 1 case）；19 cases had SLC26A4 gene mutations（c.919-2A＞G homozygous mutation in 4 cases，c.919-2A＞G heterozygous mutation in 13 cases，c.919-2A＞G/c.2168A＞G compound heterozygous mutation in 1 case）and 2 cases had mitochondrial DNA 12SrRNA m.1555A＞G mutations.Conclusion SLC26A4 gene mutations are the most common hot spot mutations in deafness patients in the Yulin area.Incidence of GJB2，SLC26A4 and mitochondrial DNA 12SrRNA gene mutations in the deafness population in Yulin is below the average of the overall Chinese deaf population.

Deafness；Genemutation；DNA microarray chip

国家自然科学资金项目（81360159）；广西科技攻关项目（桂科攻14124004-1-20）；柳州市科技攻关项目（2014J030401）；柳州市科学研究与技术开发计划项目研究成果资助（2014G020404）

1.柳州市妇幼保健院柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，广西，柳州545001 2.柳州市妇幼保健院医学遗传科，广西，柳州545001 3.柳州市妇幼保健院听力诊断中心，广西，柳州545001

★通讯作者：严提珍，E-mail：439078813@qq.com