凡纳滨对虾腐败优势菌的分离鉴定及其群体感应信号分子测定

李 灿，张煜琛，孙力军，王雅玲，梁美晶，胡汉桥，徐德峰，刘 颖，叶日英

（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088）

凡纳滨对虾腐败优势菌的分离鉴定及其群体感应信号分子测定

李 灿，张煜琛，孙力军*，王雅玲，梁美晶，胡汉桥，徐德峰，刘 颖，叶日英

（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088）

从凡纳滨对虾中分离和鉴定腐败优势菌，并对其进行群体感应信号分子AHLs和AI-2的测定。通过细菌自动生化鉴定系统和16S rDNA序列鉴定优势腐败菌；利用生物检测菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1测定其AHLs、哈维弧菌（Vibrio harveyi）BB170检测其AI-2，并探究其动态生成规律。最终分离得到10 株腐败优势菌，有4 株菌均为变形杆菌属（Proteus），其他分别为Oceanisphaera profunda、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短杆菌属（Brevibacterium）、Bacillus siamensis、Exiguobacterium aaestuarii。分离腐败优势菌中的6 株革兰氏阴性菌均产生AHLs信号分子；变形杆菌属、腐败希瓦氏菌、短杆菌属、Bacillus siamensis产生AI-2信号分子。优势腐败菌的AHLs活性与菌体生长密度呈正相关，AI-2产生量在菌体生长对数期累积，在菌体生长24 h后活性迅速减弱。

凡纳滨对虾；优势腐败菌；群体感应；信号分子

李灿， 张煜琛， 孙力军， 等. 凡纳滨对虾腐败优势菌的分离鉴定及其群体感应信号分子测定［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608029. http://www.spkx.net.cn

LI Can， ZHANG Yuchen， SUN Lijun， et al. Isolation and identification of dominant spoilage bacteria from Litopenaeus vannamei and detection of quorum sensing signaling molecules［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 164-169. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608029. http://www.spkx.net.cn

对虾中营养物质和水分含量高，pH值接近中性，其中可溶性蛋白质含量较高。细菌很容易利用和分离其所需蛋白质，产生胺、硫化物、醛、酮、酯和有机酸等［1-3］，使得对虾产生不良气味、感官和食用品质下降、发生腐败［4-5］。通过对水产食品腐败微生物长期研究发现，水产食品所含微生物中只有部分微生物参与腐败过程，称为特定腐败菌［2］，又称优势腐败菌。探求导致对虾腐败的优势腐败菌种类，能有效进行品质变化的监控和产品腐败的靶向抑制，是研发加工保藏技术、提高对虾品质的前提。

细菌能产生并释放一种称为自体诱导物质的信号分子。当信号分子达到一定的浓度阈值就会启动细菌体内相关基因的表达，使其适应不同的环境变化，这种调控系统被称为群体感应（quorum sensing，QS）系统［6-7］。革兰氏阴性细菌产生的群体感应信号分子有AHLs和AI-2两大类［8-9］。有研究［10-11］表明，食品腐败变质及腐败指标与细菌的群体感应现象及AHLs、AI-2信号分子有着密切的关系。

有研究曾报道冻藏条件下对虾优势腐败菌主要有假单胞菌、气单胞菌、腐败希瓦氏菌、乳酸菌、不动杆菌属和短杆菌属，并对这些菌的信号分子［12-13］及其作用［14］进行了相应研究。但不同的贮藏条件及处理方式［15-16］会对优势腐败菌群的种类产生一定影响，其产生的信号分子种类及其浓度也不一量，而此方面的研究相对缺乏。此外，对于优势菌菌种间信息交流及调控的AI-2信号分子研究相对较少，更缺少对于其信号分子的动态生成规律探究。本研究对凡纳滨对虾常温和4 ℃贮藏条件下腐败进程中的优势腐败菌进行了分离、鉴定，利用群体感应信号分子生物检测菌根癌脓杆菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1、哈维弧菌（Vibrio harveyi）BB170，分别检测其AHLs、AI-2信号分子产生情况并探究其动态生成规律，为对虾优势腐败菌及其群体感应相关研究积累资料。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

凡纳滨对虾（鲜活） 市售。

根癌脓杆菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1、R10，由南京农业大学朱军教授惠赠；哈维弧菌（Vibrio harveyi）BB170、BB152，由中国农业科学院韩先干教授惠赠。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

VITEK-60全自动细菌鉴定仪 法国梅里埃公司；Infinite®M1000 TECAN全功能酶标仪 苏州赛恩斯仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1优势腐败菌的分离、纯化与鉴定

将鲜活对虾冰猝死后置于无菌锥形瓶中，于4 ℃和常温条件下，参照郭红等［17］的方法进行细菌的分离，挑取占各稀释梯度平板总数40%以上的单菌落进行纯化。根据细菌菌落特征、革兰氏染色、镜检，参照叶日英等［18］的方法进行细菌自动生化鉴定并进行16S rDNA测序、鉴定。通过BLAST软件将其与GenBank中所有已测得原核生物的16S rDNA序列进行比对，将比对结果中相近模式生物的16S rDNA序列下载下来用ClustalX 1.8软件进行分析，导入到MEGA 6.0软件中构建细菌的16S rDNA基因系统发育树，确定其种属。

1.2.2优势腐败菌AHLs活性的检测

筛选出对虾优势腐败菌中的革兰氏阴性菌，其群体感应信号分子AHLs的提取与活性测定参照文献［19］中的平板划线法及β-半乳糖苷酶法进行。

平板划线法：在含0.8%琼脂的LB平板上涂布40 μL 40 mg/mL的X-gal，将生物检测菌JZA-1和待测腐败菌培养菌液“非”字划线于平板上，无菌风吹干平板表面，28 ℃倒置培养24 h，R10为阳性对照菌。

β-半乳糖苷酶法：按1∶100将过夜培养的JZA-1加入AT培养基中，加入10%（V/V）待测腐败菌上清提取物（0.22 μm孔径滤膜过滤），28 ℃振荡培养至OD600nm为0.4～1.0。取0.2 mL上述培养物于2 mL离心管中，加入0.8 mL Z-buffer、1 滴0.5%十二烷基磺酸钠、3 滴氯仿，剧烈振荡15 s后加入100 μL 3 mg/mL的显色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG），计时至溶液显黄色，加入0.6mL 1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测OD420nm，根据以下公式计算β-半乳糖苷酶活性：

式中：T为反应所需时间/min；V为0.2 mL。

1.2.3优势腐败菌AI-2活性的检测

对虾优势腐败菌群体感应信号分子AI-2的提取与活性测定参照文献［20］的方法进行。用AB培养基以1∶5 000稀释BB170培养物，加入BB152培养上清液作为阳性对照、LB液体培养基作为空白对照，28 ℃孵育6 h，用多功能酶标仪检测量品诱导BB170发光情况。以BB152诱导BB170的发光值为100%，其他组AI-2活性值为发光值与BB152发光值的百分比值。

1.2.4优势腐败菌生长密度及AHLs、AI-2的动态检测

分别按1.2.2节的AHLs检测方法和1.2.3节中的AI-2检测方法，在优势腐败菌camtB、camtE、camtF、camtG、camtH培养0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、42、48 h时，检测其AHLs和AI-2产生量活性变化，并测菌液生长密度OD600nm。

1.3数据分析

2　结果与分析

2.1优势腐败菌的鉴定结果

表1　优势腐败菌生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification of dominant spoilage organisms

续表1

经平板纯化后最终共得到10 株优势腐败菌。经细菌自动生化鉴定系统鉴定出其中8 株菌（表1）。有4 株为羽状变形杆菌属（Proteus penneri，99%）：camtB、camtE、camtG、camtH，另外4 株分别为camtA-类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes，89%）、camtC-假结核耶尔森（氏）菌（Yersinia pseudotuberculosis，96%）、camtF-腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，93%）、camtK-少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis，97%）。将分离得到的10 株优势腐败菌的16S rDNA部分序列进行测序鉴定，与GenBank中所有已测得原核生物的16S rDNA序列进行比对，得到这10 株菌分别为camtA-Oceanisphaera profunda，97.87%、camtB、camtE、camtG、camtH-变形杆菌属（Proteus，100%），camtC-溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus，100%），camtF-腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，100%），camtI-短杆菌属（Brevibacterium，100%），camtJ-Bacillus siamensis，99.89%，camtK-Exiguobacterium aaestuarii，99.79%。

对虾的多种相关研究认为，其腐败变质多以细菌性腐败为主，其优势腐败菌通常是一种或几种。本研究从常温和4 ℃贮藏条件下对虾腐败进程中分离出10 株优势腐败菌，包括Oceanisphaera profunda、变形杆菌属（Proteus）、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短杆菌属（Brevibacterium）、Bacillus siamensis以及Exiguobacterium aaestuarii，其分别占总平板菌落总数的9.2%、7.5%、6.4%、7.1%、5.9%、6.1%、8.2%。进一步证实凡纳滨对虾的腐败以细菌性腐败为主，与叶日英等［18］在冷藏条件下分离得到的新鲜对虾内源优势腐败菌是短杆菌属以及郭红等［17］研究南美白对虾在冰温条件下达到一级鲜度时其特定腐败菌为希瓦氏菌属相一致。其中某些未见报道过的优势菌群如变形杆菌属的出现可能是由于实验设置温度条件及对虾原料的差异导致。本研究中应用的细菌自动生化鉴定系统与16S rDNA鉴定结果有所不同，其原因可能为生化鉴定系统数据库信息不足，以及普通生化鉴定项目不够全面无法为细菌鉴定提供准确结果。因此生化鉴定只能作为菌种鉴定中的一个辅助手段，如需准确对菌株进行鉴定则需应用16S rDNA序列。

2.2优势腐败菌AHLs的提取及活性

将筛选出的6 株革兰氏阴性优势腐败菌与生物检测菌JZA-1平板划线，观察颜色变化，其中camtA、camtF、camtG、camtH以及阳性对照菌R10可诱导JZA-1水解X-gal产生特征性的蓝绿色（图1中未显示颜色），说明可产生AHLs类信号分子，但特征性蓝绿色有深有浅，如图1所示。

图1　优势腐败菌AHLs产生情况Fig.1 AHLs production of dominant spoilage organism

由β-半乳糖苷酶法检测6 株革兰氏阴性优势腐败菌的AHLs活性，根据公式计算得到活性有效值（millerunits，MU），结果见图2。其中camtF、camtG、camtH的MU值较高，分别为131.31、70.73、65.13 MU（P＜0.05），与阳性对照组R10相对百分比分别为152%、88.7%、75.2%，其AHLs活性较高，camtE的MU值较低。结果显示分离得到的6 株革兰氏阴性优势腐败菌均能产生AHLs信号分子，这与平板划线法诱导生物检测菌JZA-1产生颜色变化的结果一致。

图2　优势腐败菌AHLs活性Fig.2 AHLs activity of dominant spoilage organisms

目前的研究证实，食品中的腐败菌多产生AHLs，其AHLs参与食品腐败变质过程的调控［11-12，21］。Jamuna等［22］研究表明AHLs对于腐败菌——假单胞菌的胞外酶和生物被膜形成有促进作用。食品的软腐是由欧文氏菌（Erwinia）产生的AHLs调控果胶酶活性加速豆芽的腐败变质［23］，导致巴氏消毒奶腐败变质的假单胞菌蛋白水解酶活性也是由QS系统所调控的［24］。刘尊英等［10］研究说明对虾优势腐败菌群体感应信号分子AHLs与其腐败指标具有显著正相关性。本研究结果表明，分离出的革兰氏阴性对虾优势腐败菌株均可产生AHLs。由AHLs介导的群体感应系统可能参与了其致腐过程，但其详细的致腐机理及相关性有待进一步研究。

2.3优势腐败菌AI-2的活性

图3　优势腐败菌AI-2活性Fig.3 AI-2 activity of dominant spoilage organisms

以哈维弧菌BB152诱导BB170发光值为100%活性，以LB培养基为空白对照，得到10 株优势腐败菌的AI-2信号分子活性检测结果，如图3所示。camtA、camtC、camtH、camtK检测值与BB152检测值比值低于空白对照，说明该4 株优势腐败菌不能有效诱导BB170发光，即不产生AI-2类信号分子；而camtB、camtE、camtF、camtG、camtI、camtJ这6 株优势腐败菌产生AI-2，且生成量相对较高。即3 株变形杆菌属Proteus、1 株腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens、1 株短杆菌属Brevibacterium、1 株Bacillus siamensis产生AI-2信号分子。

AI-2类信号分子主要作用于菌种间的信息交流［25-26］，Widmer等［14］研究表明AI-2对于菌株的众多毒力基因调控十分关键，Dourou等［27］研究表明其对其他菌株的生长有重要作用。单个菌群存在时其产量可能较弱，因此纯培养条件下AI-2的产生量较少甚至某些菌株不产生。本研究分离得到的6 株优势腐败菌能有效测出AI-2类信号分子，其他株优势腐败菌可能是由于产生量少，生物检测菌BB170未能有效检出或者纯培养条件下不产生AI-2。

2.4优势腐败菌生长密度及AHLs、AI-2的动态变化

图4　优势腐败菌生长密度动态变化Fig.4 Dynamic cell density of dominant spoilage organisms

优势腐败菌camtB、camtE、camtF、camtG、camtH的48 h菌体动态生长变化如图4所示，这5株优势腐败菌生长趋势相同，符合微生物生长“J”型图。0～3 h菌群生长较缓，菌群处于生长调整期，3～21 h腐败菌生长迅速，进入对数生长期，达到21～24 h后生长减缓，为对数后期，24～48 h进入生长平稳期，菌群生长相对静止。

图5　优势腐败菌AHLs活性动态变化Fig.5 Dynamic AHLs activity of dominant spoilage organisms

在汪映［28］的研究中，副溶血弧菌AHLs活性动态变化为随着培养时间的延长先升高后降低，在对数生长末期（18 h）达到最大值。本研究得到的优势腐败菌AHLs活性变化如图5所示，在0～18 h时，AHLs生成量随着菌体密度增加而持续累积，在菌体对数生长后期（21～24 h）达到最大值；菌体进入平稳期（24～48 h）后，AHLs量变化较小。可能是由于优势腐败菌生长后期其培养液酸碱环境无较大变化，AHLs高丝氨酸内酯环结构较稳定，因此活性变化不大。优势腐败菌AHLs活性变化与生长变化呈正相关。

图6　优势腐败菌AI-2活性动态变化Fig.6 Ddynamic AI-2 activity of dominant spoilage organisms

如图6所示，AI-2生成量活性变化趋势均呈“倒钟型”。在0～18 h，AI-2随菌体密度持续累积，达到最大峰值；在菌体对数生长后期（21～24 h），AI-2的活性相对平稳，出现一个最大峰值平台；当菌体进入平稳期24～48 h后，AI-2的活性急剧下降，48 h时，AI-2几乎降至初始值。汪映［28］在副溶血弧菌AI-2信号分子的动态检测研究中表明其具有一定的生长阶段依赖性，AI-2在对数生长后期达到峰值后仍保持较高的活性水平。结合本研究结果分析，信号分子AI-2的活性值不仅与腐败菌菌体密度有关，且其活性不稳定，能被培养液中菌体产生的某些代谢物降解，或者其可能与菌体生理代谢相关，即可参与胞体生长代谢，被胞体吸收利用。

3　结 论

本研究分离得到了10 株优势腐败菌，有4 株均为变形杆菌属（Proteus）。其他分别为Oceanisphaera profunda、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短杆菌属（Brevibacterium）、Bacillus siamensis、Exiguobacterium aaestuarii。这些菌株中的6 株革兰氏阴性菌均产生AHLs信号分子，其AHLs活性与菌体生长密度呈正相关。其中6 株（3 株变形杆菌属Proteus、1 株腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens、1 株短杆菌属Brevibacterium、1 株Bacillus siamensis）产生AI-2信号分子。AI-2信号分子活性不稳定，其产生量在菌体生长对数期累积，在菌体生长24 h后活性迅速减弱。本研究结果将为水产品优势腐败菌群体感应系统及其与腐败之间的关系研究积累资料，也可以为对虾剩余货架期预测和以群体感应系统为靶点进行保鲜贮藏新方法的开发提供依据。

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Isolation and Identification of Dominant Spoilage Bacteria from Litopenaeus vannamei and Detection of Quorum Sensing Signaling Molecules

LI Can， ZHANG Yuchen， SUN Lijun*， WANG Yaling， LIANG Meijing， HU Hanqiao， XU Defeng， LIU Ying， YE Riying
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China）

This study was aimed at isolating， identifying the dominant spoilage bacteria from Litopenaeus vannamei using an automatic biochemical identification system and 16S rDNA sequence， detecting the quorum sensing signaling molecules acyl homoserine lactones （AHLs）， autoinducer-2 （AI-2） and exploring the dynamic formation regularities with indicator bacteria Agrobacterium tumefaciens JZA-1 and Vibrio harveyi BB170， respectively. Ten strains were selected and identified，including Oceanisphaera profunda， Stapylococcus haemolyticus， Shewanella putrefaciens， Brevibacterium sp.， Bacillus siamensis， Exiguobacterium aaestuarii and four strains of the Proteus genus. All the Gram-negative spoilage organisms isolated secreted signaling molecule AHLs while Proteus sp.， Shewanella putrefaciens， Brevibacterium sp. and Bacillus siamensis secreted signaling molecule AI-2. The AHLs activity of dominant spoilage organism was positively correlated with cell density. The AI-2 production was accumulated within the logarithmic phase and decreased rapidly from 24 h onwards.

Litopenaeus vannamei； dominant spoilage organism； quorurm sensing； signaling molecule

10.7506/spkx1002-6630-201608029

TS254.1

A

1002-6630（2016）08-0164-06

2015-07-08

国家自然科学基金面上项目（31371746；31201309；31171634）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD29B06）；广东省高等学校创新强校项目（GDOU2013050312；GDOU2013050205；GDOU2013050203）

李灿（1991—），女，硕士研究生，主要从事水产品质量与安全研究。E-mail：lican625@163.com

孙力军（1965—），男，教授，博士，主要从事水产品质量与安全研究。E-mail：dfsun01@126.com

引文格式：