高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

赵新宇，陈杨阳，陈敬帮，蔡冬波，魏雪团,

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070）

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

赵新宇1,2，陈杨阳2，陈敬帮2，蔡冬波2，魏雪团1,2,*

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070）

以产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10（pP43SNT-SsacC）为出发菌株，开展其全合成培养基的发酵优化研究。通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基成分，获得了最优的培养基组成（g/L）：葡萄糖30、NaNO330、谷氨酸钠20、柠檬酸钠15、MgSO4g7H2O 0.5、K2HPO4g3H2O 1.5、CaCl20.5，pH 7.2。在优化的全合成培养基中，纳豆激酶最高酶活力达到25.59 FU/mL，相比于初始培养基发酵活性（4.27 FU/mL），提高了5 倍。对比分析了全合成培养基和半合成培养基的发酵产物，结果表明，全合成培养基可显著提高纳豆激酶的纯度，与半合成培养基相比，纳豆激酶比活力提高了2 倍。本研究获得了纳豆激酶的全合成培养基成分，显著提高了纳豆激酶发酵活性，并进一步提高了纳豆激酶发酵纯度。

纳豆激酶；地衣芽孢杆菌工程菌；全合成培养基；发酵优化

心血管疾病严重危害人类健康，已成为威胁人类生命的“头号杀手”[1]。血栓是造成心血管疾病的主要原因，血栓的主要成分是纤维蛋白[2]，溶解纤维蛋白对预防和治疗心血管疾病具有重要的意义。纳豆激酶（nattokinase，NK）不仅可直接降解纤维蛋白，而且可激活体内纤溶酶的形成，促进纤维蛋白的降解[3-4]，因而对治疗和预防心血管疾病具有重要的意义。NK溶栓性强，半衰期长，无毒副作用，已被开发为保健食品，深受心血管疾病患者的青睐[5]。

目前，NK多是通过野生纳豆芽孢杆菌发酵生产[6]。野生菌株合成纳豆激酶的途径复杂，是多种代谢途径共同参与的结果[7]。其中，添加无机氮源可抑制NK的合成，因此，野生菌发酵过程中往往需要大量有机氮源成分[8-9]，如固体发酵多以天然黄豆为底物进行发酵，液体发酵多是利用半合成培养基进行发酵[10-11]。由于天然培养基和半合成培养基成分多样，杂蛋白、多肽比较多，导致分离纯化过程复杂[12-13]，制备高纯度产品成本较高[14]。同时，野生菌分泌胞外杂蛋白种类繁多，增加了NK分离纯化的难度[15]。因此，减少培养基天然杂蛋白和生产菌自身杂蛋白含量，有望提高NK的纯度。

本实验室前期构建了10基因缺失的新型地衣芽孢杆菌宿主菌BL10，敲除了野生菌中大量的胞外蛋白酶和冗余蛋白，降低胞外蛋白酶对NK的降解作用，实现了NK的高效组成型表达[16]，但还未从全合成培养基角度进行NK发酵优化。因此，本研究以前期构建的地衣芽孢杆菌工程菌为出发菌株，进行其全合成培养基优化研究，有助于提高NK的纯度，获得高活性的NK产品。

1 材料与方法

1.1 菌种

地衣芽孢杆菌工程菌株BL10（pP43SNT-SsacC），为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室微生物工程室构建保存，可组成型表达NK。

1.2 试剂

纤维蛋白原、凝血酶 美国Sigma-Aldrich公司；酵母抽提物、胰蛋白胨 英国Oxoid公司；葡萄糖 西王药业有限公司；谷氨酸钠、柠檬酸钠、NH4Cl、NaNO3、谷氨酸钠、MnSO4等 国药集团化学试剂有限公司。

1.3 培养基

LB固体培养基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、琼脂粉20，pH 7.2；LB液体培养基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，pH 7.2；初始发酵培养基（g/L）：蔗糖10、NH4Cl 10、柠檬酸钠 5、谷氨酸钠5、MnSO4gH2O 0.15、MgSO4g7H2O 1、K2HPO4g3H2O 1、CaCl21，pH 7.2。在本实验中，根据研究目的，调整碳源、氮源、无机盐及其他成分种类和用量。

半合成培养基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、大豆蛋白胨10、酵母粉15、玉米浆5、K2HPO4g3H2O 0.5、MgSO4g7H2O 0.1、CaCl2g2H2O 0.1，pH 7.2～7.4。

1.4 发酵方法

1.4.1 种子培养

取BL10（pP43SNT-SsacC）甘油管保藏的菌液，划线至LB（四环素质量浓度20 μg/mL）固体培养基，37 ℃培养18 h，保存至4 ℃冰箱中，备用；挑取单菌落接种至液体LB（四环素质量浓度20 μg/mL），37 ℃、240 r/min培养12 h活化菌体，按2%的接种量接种至液体LB（四环素质量浓度20 μg/mL）中，37 ℃、240 r/min培养8 h，即为发酵种子液。

1.4.2 发酵培养条件

按照3%的接种量将种子液接种于装有30 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，37 ℃、240 r/min培养36 h。

1.4.3 单因素试验优化

在初始发酵培养基的基础上，通过单因素试验考察碳氮源种类、碳氮源质量浓度、谷氨酸钠质量浓度、柠檬酸钠质量浓度、金属盐离子浓度等因素对酶活力的影响：碳源种类包括葡萄糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、可溶性淀粉，质量浓度均为10 g/L；选择适宜碳源，质量浓度梯度设为0、10、20、30、40、50 g/L；氮源种类包括NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2CO3、NaNO3，质量浓度均为10 g/L；选择适宜氮源，氮源质量浓度梯度设为0、10、20、30、40、50 g/L；谷氨酸钠质量浓度梯度设为5、10、15、20 g/L；柠檬酸钠质量浓度梯度设为0、5、10、15、20 g/L；MnSO4质量浓度梯度设为0、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L；MgSO4质量浓度梯度设为0、0.5、1.0、1.5 g/L；CaCl2质量浓度梯度设为0、0.5、1.0、1.5 g/L；K2HPO4质量浓度梯度设为0、0.5、1.0、1.5 g/L。

1.4.4 正交试验优化

在单因素试验优化的基础上，设计四因素三水平正交试验，优化碳氮源质量浓度、谷氨酸钠和柠檬酸钠质量浓度，确定最优组合。

1.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

取0.9 mL发酵上清液，加入0.1 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，颠倒10 次混匀，4 ℃过夜放置，13 000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.2 mL无水乙醇洗涤，13 000 r/min离心10 min，弃上清，依此重复洗涤3 次，37 ℃吹干，加入30 μL包含8 mol/L尿素和2 mol/L硫脲溶液溶解蛋白质样品，再加入30 μL 2hSDS-PAGE上样缓冲液和3 μL 1 mol/L二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），100 ℃水浴10 min溶解沉淀。SDS-PAGE凝胶参考《分子克隆实验指南》进行配制[17]。将溶解好的蛋白质离心后取20 μL上样，用80 V的电压电泳，当溴酚蓝指示剂从浓缩胶进入分离胶后，电压调到120 V，继续电泳直到溴酚蓝指示剂抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。电泳结束后，于考马斯亮蓝R250染色液中处理1～2 h，最后于脱色液中处理数次直至条带清晰。

1.6 纳豆激酶酶活力测定

本研究采用纤维蛋白原溶解法测定NK活性[18]。反应中所需的纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液都用50 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.8）溶液配制，向试管中加入1.8 mL纤维蛋白原溶液（2 mg/mL），然后加入0.1 mL凝血酶溶液，37 ℃恒温箱中静置10 min，形成纤维蛋白凝块；加入0.1 mL稀释后的待测酶液，放入恒温箱开始计时，每20 min轻轻晃动一次，反应1 h后，迅速加入2 mL TCA溶液（100 g/L）终止反应，静置20 min；10 000 r/min离心10 min，取上清液在275 nm波长处测定其吸光度值，1 个单位的酶活力（1 FU）定义为每分钟使吸光度值增加0.01所需要的纳豆激酶的量。

2 结果与分析

2.1 全合成培养基优化结果

2.1.1 碳源优化结果

图1 碳源种类及最适碳源质量浓度对NK酶活性的影响Fig.1 Effect of carbon source type and glucose concentration on nattokinase activity

如图1A所示，当菌体在初始培养基以蔗糖为碳源时，发酵活性达4.27 FU/mL，当以葡萄糖、木糖、麦芽糖和可溶性淀粉为碳源时，都能提高NK的发酵活性，其中，葡萄糖可促进合成最高的NK发酵活性。因此，葡萄糖为地衣芽孢杆菌BL10（pP43SNT-SsacC）合成NK的最适碳源，这与先前在枯草芽孢杆菌中报道的结论相一致[19-20]。

以葡萄糖为碳源，研究了不同葡萄糖质量浓度对NK活性的影响。不添加葡萄糖时，仍能检测到微弱的NK活性，这是由于培养基中柠檬酸钠和谷氨酸钠可作为碳源供菌体利用。添加葡萄糖后，NK活性显著提高，当葡萄糖质量浓度超过20 g/L时，NK发酵活性没有显著性变化，因此，选择20 g/L为NK发酵的适宜碳源质量浓度，与先前报道的结果接近[21]。

2.1.2 氮源优化结果

首先，考察了氮源种类对NK发酵活性的影响，在以NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和NaNO3为氮源时，可以获得较高活性的NK（图2A），说明无机氮源可作为基因工程菌表达NK的适宜氮源。在野生菌中，无机氮源如铵盐可抑制NK的合成，先前的报道都是以有机氮源进行发酵[19]。本实验所用基因工程菌可组成型表达NK，在调控机制上与野生菌不同，这可能是无机氮源促进NK表达的原因。

选择NaNO3作为适宜氮源，考察不同质量浓度NaNO3对NK发酵活性的影响，结果如图2B所示，由于谷氨酸钠可以作为氮源被细菌利用，因此，不添加NaNO3时，细菌仍可合成NK，但活性较低，添加NaNO3后，活性显著提高，当NaNO3质量浓度为20 g/L时，NK发酵活性达到最大。

图2 氮源种类及最适氮源质量浓度对NK酶活性的影响Fig.2 Effect of nitrogen source type and NaNO3concentration on nattokinase activity

2.1.3 不同谷氨酸钠质量浓度对纳豆激酶发酵活性的影响

先前的报道发现谷氨酸钠是NK重组表达的限制性因素，添加谷氨酸钠可显著提高NK的分泌表达[22]，因此，本研究考察了不同谷氨酸钠质量浓度对NK发酵的影响。图3显示在不同谷氨酸钠质量浓度下NK的发酵活性，当谷氨酸钠质量浓度为10 g/L时，NK发酵活性达到最大值，因此，初步选择10 g/L的谷氨酸钠为适宜质量浓度。

图3 不同谷氨酸钠质量浓度对NK酶活性的影响Fig.3 Effect of sodium glutamate concentration on nattokinase activity

2.1.4 不同柠檬酸钠质量浓度对纳豆激酶酶活性的影响

图4 不同柠檬酸钠质量浓度对NK酶活性的影响Fig.4 Effect of sodium citrate concentration on nattokinase activity

由图4可知，不添加柠檬酸钠时，发酵活力只有3.85 FU/mL，添加5 g/L的柠檬酸钠，发酵活性显著提高，说明柠檬酸钠对NK发酵活性较大的促进作用。推测其原因如下：柠檬酸是三羧酸循环的重要中间代谢物，可促进谷氨酸的合成，进而促进NK的表达。当柠檬酸钠质量浓度为20 g/L时，发酵活性最高，因此选择20 g/L的柠檬酸钠为适宜发酵条件。野生菌在20 g/L的柠檬酸钠质量浓度时，NK活性很低[6]，这进一步说明工程菌和野生菌在NK合成调控机制上的不同。

2.1.5 不同无机盐质量浓度对纳豆激酶酶活性的影响

图5 不同无机盐质量浓度对NK酶活性的影响Fig.5 Effect of inorganic salt concentration on nattokinase activity

由图5可知，添加MnSO4可降低发酵活性，因此培养基中不需要添加MnSO4。添加MgSO4、CaCl2、K2HPO4可显著提高NK发酵活性，适宜质量浓度分别为MgSO40.5 g/L、CaCl20.5 g/L、K2HPO41.5 g/L。

2.1.6 正交试验优化发酵培养基的组成

表1 发酵培养基组分正交试验方案及结果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of medium components

在单因素优化的基础上，选择4 种主要培养基成分葡萄糖、NaNO3、谷氨酸钠和柠檬酸钠，设计四因素三水平正交试验及其结果如表1所示，极差R值大小顺序为：A＞C＞B＞D，说明葡萄糖质量浓度对NK活性影响最大，其次是谷氨酸钠质量浓度、NaNO3质量浓度和柠檬酸钠质量浓度。K值分析结果显示，4 种成分的最优组合为A3B3C3D3，即葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸钠20 g/L、柠檬酸钠15 g/L，最适质量浓度与上述单因素试验所得结果不一致，分析其原因，可能是4 种成分之间存在交互作用，这也正是正交试验相比单因素试验的优点，可以综合考察单因素之间的交互作用，获得最优的水平组合。依据此组合进行发酵验证实验，最终NK活力为25.78 FU/mL，高于正交试验中所有的组合，说明该配比确实为最适产酶培养基。综合单因素试验和正交试验结果，确定NK的适宜发酵培养基组成为：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸钠20 g/L、柠檬酸钠15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2。

2.1.7 NK发酵过程曲线

以最适产酶培养基为基础，进行NK发酵过程曲线绘制，包括菌体生长及NK合成过程。如图6所示，随着菌体的生长，NK快速合成，NK的合成与生长相偶联，这与前期的报道相符[23]。同时NK在发酵初期合成速率较快，这可能是由于NK游离表达质粒在初期相对稳定，随着菌体的生长，出现部分质粒丢失现象，导致后期合成速率下降。发酵18 h时，NK活性达到最大，为25.59 FU/mL，比初始发酵培养基发酵活性（4.27 FU/mL）相比，提高了5 倍。目前，NK工业化生产多以固体发酵纳豆的形式进行，商业化纳豆产品的NK酶活力在20～40 FU/mL[24-25]，本实验所得的最大NK酶活性达到了商业化固体发酵工艺的水平，具有良好的应用前景。

图6 菌体生长曲线及NK活性曲线Fig.6 Time courses of cell growth and nattokinase activity

2.2 全合成培养基发酵产物分析

将最适培养基得到的发酵产物进行SDS-PAGE分析，同时以实验室先前优化的半合成培养基为对照[16]，结果如图7所示，其中分子质量约为27.7 kD的条带为NK条带，与已有报道的结果相一致[16]。由于半合成培养基以蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉和玉米浆为氮源，含有大量杂蛋白和多肽类物质，故发酵产物中杂带较多，相比之下，本研究所得的全合成培养基中无杂蛋白，发酵产物中杂蛋白较少，易于纯化。以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为标准品分析发酵液中总蛋白含量，计算两种发酵液中NK的酶比活力，全合成培养基发酵液中总蛋白含量为100 mg/L，NK的酶比活力达到255.90 FU/mg pro，半合成培养基发酵液的总蛋白含量为400 mg/L，发酵酶活力和酶比活力分别为33.83 FU/mL和84.58 FU/mg pro，相比之下，全合成培养基比半合成培养基发酵制备的NK酶比活力提高了2 倍，说明全合成培养基有利于高纯度NK的发酵制备。

图7 不同培养基成分发酵产物的SDS-PAGE分析结果Fig.7 SDS-PAGE of fermented products from different media

3 讨 论

本研究获得了纳豆激酶发酵的最适全合成培养基成分：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸钠20 g/L、柠檬酸钠15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2，最大NK活力达到25.59 FU/mL，相比于初始培养基的发酵活性（4.27 FU/mL）提高了5 倍。与半合成培养基相比，全合成培养基所发酵制备的纳豆激酶中杂蛋白显著降低，纳豆激酶比活性提高了2 倍，有利于获得高纯度的纳豆激酶产品。本研究提供了一种高效生产纳豆激酶的全合成培养基配方，并有利于制备高纯度的纳豆激酶产品。

[1] 林超, 刘兆国, 钱星, 等. 丹酚酸B在心血管疾病中药理作用研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015(4): 449-452. DOI:10.3969/ j.issn.1001-1978.2015.04.002.

[2] WEI Xuetuan, LUO Mingfang, XIE Yuchun, et al. Strain screening, fermentation, separation, and encapsulation for production of nattokinase functional food[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168: 1753-1764. DOI:10.1007/s12010-012-9894-2.

[3] DABBAGH F, NEGAHDARIPOUR M, BERENJIAN A, et al. Nattokinase: production and application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(22): 9199-9206. DOI:10.1007/s00253-014-6135-3.

[4] XU Jianping, DU Ming, YANG Xiulin, et al. Thrombolytic effects in vivo of nattokinase in a carrageenan-induced rat model of thrombosis[J]. Acta Haematologica, 2014, 132(2): 247-253. DOI:10.1159/000360360.

[5] PENG Yong, YANG Xiaojuan, ZHANG Yizheng. Microbial fibrinolytic enzymes： an overview of source， production， properties，and thrombolytic activity in vivo[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 69(2): 126-132. DOI:10.1007/s00253-005-0159-7.

[6] MAHAJAN P, GOKHALE S, LELE S. Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, scale up, and kinetic modeling[J]. Food Science and Biotechnology, 2010, 19(6): 1593-1603. DOI:10.1007/s10068-010-0226-4.

[7] UNREAN P, NGUYEN N H A. Metabolic pathway analysis and kinetic studies for production of nattokinase in Bacillus subtilis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2013, 36(1): 45-56. DOI:10.1007/s00449-012-0760-y.

[8] WANG Sanlang, WU Yingying, LIANG Tzuwen. Purification and biochemical characterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell with Bacillus subtilis TKU007[J]. New Biotechnology, 2011, 28(2): 196-202. DOI:10.1016/j.nbt.2010.09.003.

[9] LIU Junguo, XING Jianmin, CHANG Tianshi, et al. Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(8): 2757-2762. DOI:10.1016/ j.procbio.2004.12.025.

[10] 王艳艳, 邓启华. 纳豆激酶液体发酵条件优化的研究[J]. 中国酿造, 2013, 32(12): 83-87. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2013.12.020.

[11] 陈明霞, 隋明. 纳豆激酶液体发酵技术研究进展[J]. 中国调味品, 2012, 37(1): 11-13. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2012.01.004.

[12] 王萍, 陈钧, 杨小明, 等. 纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究[J]. 食品科学, 2005, 26(2): 59-63. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2005.02.009.

[13] LIU C H, WU W C, LAI H Y. Adsorption of nattokinase by amino acid-conjugated magnetic nanoadsorbents[J]. Separation Science and Technology, 2013, 48(6): 923-930. DOI:10.1080/01496395.2012.719564.

[14] 孔鹏, 谢渝春, 魏雪团, 等. 超顺磁性聚醋酸乙烯酯微球亲和分离纳豆激酶[J]. 过程工程学报, 2012(1): 105-111.

[15] GARG R, THORAT B N. Nattokinase purification by three phase partitioning and impact of t-butanol on freeze drying[J]. Separation and Purification Technology, 2014, 131: 19-26. DOI:10.1016/ j.seppur.2014.04.011.

［16］ WEI X， ZHOU Y， CHEN J， et al. Efficient expression of nattokinase in Bacillus licheniformis: host strain construction and signal peptide optimization[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2015, 42(2): 287-295. DOI:10.1007/s10295-014-1559-4.

[17] 萨姆布鲁克J, 拉塞尔D W. 分子克隆实验指南[M]. 黄培堂, 等, 译. 3版. 北京: 科学出版社, 2005: 1713-1720.

[18] WEI X, LUO M, LIU H. Preparation of the antithrombotic and antimicrobial coating through layer-by-layer self-assembly of nattokinase-nanosilver complex and polyethylenimine[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2014, 116: 418-423. DOI:10.1016/ j.colsurfb.2014.01.034.

[19] 王常苏, 孙晓彤, 余洁, 等. 纳豆激酶高活性菌株BN-05鉴定及发酵工艺优化[J]. 中国酿造, 2014, 33(1): 91-95. DOI:10.3969/ j.issn.0254-5071.2014.01.022.

[20] KWON E Y, KIM K M, KIM M K, et al. Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2011, 34(7): 789-793. DOI:10.1007/ s00449-011-0527-x.

[21] KU T, TSAI R L, PAN T M. A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1): 292-296. DOI:10.1021/jf8024198.

[22] CHEN P, CHAO Y. Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19): 1595-1600. DOI:10.1007/ s10529-006-9126-3.

[23] CHO Y H, SONG J Y, KIM K M, et al. Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis[J]. New Biotechnology, 2010, 27(4): 341-346. DOI:10.1016/j.nbt.2010.06.003.

[24] WEI X, LUO M, XU L, et al. Production of fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens by fermentation of chickpeas, with the evaluation of the anticoagulant and antioxidant properties of chickpeas[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(8): 3957-3963. DOI:10.1021/jf1049535.

[25] TAKAOKA S. Bacillus natto culture extract: 6730504[P]. 2004-04-05.

Optimization of Synthetic Complete Medium for Enhanced Nattokinase Production by Genetically Engineered Bacillus licheniformis

The nattokinase-producing genetically engineered strain, Bacillus licheniformis BL10 (pP43SNT-SsacC) was used in this study, and the synthetic complete medium composition for nattokinase production by the strain was optimized using combination of single factor and orthogonal tests. The maximum nattokinase activity of 25.59 FU/mL, which was 6 times higher than that (4.27 FU/mL) before optimization, was obtained using a medium consisting of 30 g/L glucose, 30 g/L NaNO3, 20 g/L sodium glutamate, 15 g/L sodium citrate, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, 1.5 g/L K2HPO4·3H2O and 0.5 g/L CaCl2at pH 7.2. The specific activity of nattokinase in the synthetic complete medium was improved by 3 folds when compared with that in semi-synthetic medium. In the present study, both the activity and purity of nattokinase were improved obviously by using the optimized synthetic complete medium.

nattokinase; genetically engineered Bacillus licheniformis; synthetic complete medium; fermentation optimization

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

10.7506/spkx1002-6630-201607026

Q812

A

1002-6630（2016）07-0140-06

赵新宇, 陈杨阳, 陈敬帮, 等. 高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化[J]. 食品科学, 2016, 37(7): 140-145. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Xinyu, CHEN Yangyang, CHEN Jingbang, et al. Optimization of synthetic complete medium for enhanced nattokinase production by genetically engineered Bacillus licheniformis[J]. Food Science, 2016, 37(7): 140-145. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

2015-05-08

湖北省自然科学基金项目（2014CFB943）；华中农业大学自主科技创新基金项目（2662015QC035）

赵新宇（1992—），女，本科生，研究方向为食品发酵。E-mail：414949799@qq.com

*通信作者：魏雪团（1984—），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn