新疆红肉苹果多酚的超声波辅助提取工艺优化

齐 娜 李 涵 张志宇 邓 红 虎 艳 郭玉蓉 孟永宏

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)



新疆红肉苹果多酚的超声波辅助提取工艺优化

齐 娜 李 涵 张志宇 邓 红 虎 艳 郭玉蓉 孟永宏

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)

利用响应面法优化超声波辅助提取新疆红肉苹果多酚的工艺条件。以新疆红肉苹果为试验原料，在单因素试验基础上选择提取时间、超声功率、提取温度及料液比4个因素进行响应面设计，采用Box-Behnken中心组合试验设计和响应面分析法，确定红肉苹果多酚的最佳提取工艺。结果表明，红肉苹果多酚的最佳提取参数为：料液比1∶4 (g/mL)，超声功率360 W，提取温度62 ℃，提取时间20 min。在该最佳条件下，新疆红肉苹果多酚得率达到2.135 mg/g。该结果可为苹果多酚的实际生产提供借鉴。

红肉苹果；多酚；超声辅助提取

中国是苹果属植物的起源中心，全世界约35个苹果种里中国有27种。中国苹果不仅种植面积和产量世界第一，其野生苹果资源也非常丰富，新疆野苹果就是其中天然存着的第三纪孑遗物种，被认为是栽培苹果的祖先[1-3]。新疆红肉苹果(Malus niedzwetzkyana Dieck)的枝、花、果皮及果肉均为红色，是一种在新疆有着悠久栽培历史的优良果树品种，更是新疆野苹果中的一种珍贵种质[4-5]，具有丰富的遗传多样性和很高的观赏与医用价值。

新疆红肉苹果具有较强的环境适应能力和抗旱、抗寒、抗病虫等特性，其外表及果肉全红吸引了很多人的注意，近年来人们发现新疆红肉苹果具备的生物功能和潜在利用价值非常高。新疆红肉苹果含有大量的花色苷[6-7]，还含有多糖、多酚等多种活性物质[8]6-7。虽然新疆红肉苹果由于口感酸涩不能鲜食而不为广大消费者所知，但是其中的苹果多酚因其抗氧化能力强，而备受人们关注[8]6-7[9]。苹果多酚，作为一种植物次生代谢产物，具有抗氧化、抗辐射、抗衰老、预防心脑血管疾病以及增强免疫力等生物活性与功效[10-12]。目前，植物多酚的提取方法较多，主要有溶剂法、超声波辅助提取、超临界CO2流体萃取等[13-14]。而其中的超声辅助提取方法具有效率高、能量低以及节省溶剂等特点，成为有效提取多酚、多糖等活性物质的新兴技术[15]。

张小燕等[16]研究发现新疆野苹果多酚物质遗传多样性极为丰富，从30株苹果中鉴定出原花青素、没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、根皮素等13种多酚物质。Wang Xiao-qian等[17]发现新疆红肉苹果的酚类物质具有很好的抗氧化能力，具有非常重要的食用与药用开发价值，但是国内外对于新疆红肉苹果多酚的提取工艺及功效等方面研究还是空白。本研究旨在探索可作为一种优质功能食品资源的新疆红肉苹果多酚的高效低耗提取工艺，为进一步研究其抗癌、调节免疫等生物活性提供依据。

为了充分利用新疆红肉苹果资源，本试验拟采取超声辅助法提取新疆红肉苹果多酚，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化提取相关参数，确定新疆红肉苹果多酚最佳工艺条件，以期为新疆红肉苹果的资源利用及其多酚的进一步研究提供理论依据，也为苹果多酚在食品及医药行业的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆红肉苹果：于2015年9月底购于新疆塔城(此时间为当地红肉苹果成熟采收季节)；

乙醇、福林酚试剂、没食子酸标准品、无水碳酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波机：SB25-12DTDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB-III型，郑州长城科工贸有限公司；

全波长酶标仪：Multiskan Go型，美国热电公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚的提取 将红肉苹果去籽全果打浆，在取样分析其水分含量的基础上，称取25.0 g红肉苹果匀浆，按相应的比例加入乙醇(浓度75%)，在确定的超声功率和温度下进行一定时间的提取，然后进行抽滤。将滤液加水定容(300 mL)后混匀，取2.5 mL稀释10倍，按照分析方法测定多酚含量，计算多酚的得率。

1.3.2 多酚含量的测定与得率计算 采用福林酚比色法测定新疆红肉苹果的多酚含量。

(1) 多酚标准曲线的绘制：以没食子酸为标准物质，根据参考文献[13]修改如下：配制0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别取上述不同浓度的没食子酸标准溶液0.5 mL，加1.0 mL的福林酚试剂，5 min后再加入Na2CO3(75 g/L)溶液2 mL，在水浴中(50 ℃)保持5 min后冷却1 h，在760 nm处测定吸光值，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(见图1)，得y=6.609 9x+0.007 2(R2=0.994 3)，该方程可用于提取物中多酚的定量测定。

(2) 多酚含量的分析：吸取一定质量浓度的样品溶液0.5 mL，与1.3.2(1)相同的方法加入试剂后测定吸光值，以0.5 mL 蒸馏水代替样品作空白，根据上述标准曲线计算含量。

(3) 多酚得率按式(1)计算：

图1 没食子酸标准曲线

(1)

式中：

R——多酚得率，mg/g；

C——样品液总酚浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

N——稀释倍数；

W——新疆红肉苹果原料重量，g。

1.3.3 多酚提取单因素试验 参考文献[13]和[18]，分别选取提取时间、超声功率、提取温度和料液比4个因素做单因素试验，做3次重复，考察各个因素对新疆红肉苹果多酚得率的影响。

(1) 提取时间：以75%的乙醇为溶剂，超声功率为300 W，提取温度为60 ℃，料液比为1∶4(g/mL)，将提取时间分别设定为10，20，30，40，50 min，然后将提取液抽滤、定容，测定多酚的含量。

(2) 超声功率：以75%的乙醇为溶剂，提取时间为20 min，提取温度为60 ℃，料液比为1∶4(g/mL)，将超声功率分别设定为240，280，320，360，400 W，然后将提取液抽滤、定容，测定多酚的含量。

(3) 提取温度：以75%的乙醇为溶剂，提取时间为20 min，超声功率为360 W，料液比为1∶4(g/mL)，将提取温度分别设定为30，40，50，60，70 ℃，然后将提取液抽滤、定容，测定多酚的含量。

(4) 料液比：以75%的乙醇为溶剂，提取时间为20 min，超声功率为360 W，提取温度为60 ℃，将料液比分别设定为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)，然后将提取液抽滤、定容，测定多酚的含量。

1.3.4 多酚提取条件的响应面优化试验 在单因素试验结果的基础上，选定超声功率、提取时间和温度、料液比四因素为自变量，以多酚的得率为响应值(即试验指标)，根据Box-Behnken 原理进行4因素3水平的试验设计。

2 结果与分析

2.1 多酚提取的单因素试验结果

2.1.1 提取时间对多酚得率的影响 由图2可知，随着提取时间的增加，多酚得率则先升高后下降，在20 min时多酚得率最高。20 min后多酚得率逐渐下降可能是由于超声处理时间过长会导致多酚的氧化降解[19-20]，也可能有其他物质溶出，影响多酚的得率。因此，提取时间选择20 min最佳。

图2 提取时间对多酚得率的影响

王贤萍等[21]的研究表明多酚的最佳提取时间为60 min，而本试验的提取时间仅为20 min，不仅提高了效率而且还避免了时间过长，造成多酚物质的氧化降解。

2.1.2 超声功率对多酚得率的影响 由图3可知，超声功率提高则多酚得率增大，当超声功率为360 W时，多酚得率达到最高，之后继续加大超声功率多酚得率降低。分析原因，可能是超声波的空化作用使得新疆红肉苹果的细胞壁更容易破碎，加快了苹果中多酚物质的溶出，增大多酚的得率[22]。但是超声功率过高，会使多酚物质发生分解，使多酚得率下降。因此，超声功率选择360 W最佳。

图3 超声功率对多酚得率的影响

超声辅助提取相对于其他方法具有高效、节能等特点，多酚得率会随着超声功率的增大而逐渐增大，但超声功率过高可能会引起其结构与活性的变化，本试验确定超声功率为360 W，比许先猛等[23]研究得出的最佳超声功率600 W要低，因而对多酚的破坏较小。但超声对多酚的具体影响还需要进一步研究确定。

2.1.3 提取温度对多酚得率的影响 由图4可知：随着温度的升高，新疆红肉苹果多酚得率逐渐增大，当温度达到60 ℃时，多酚得率最高，再继续升高温度得率却逐渐降低。分析认为，温度升高，会使物质内的分子运动加快，酚物质的渗透与扩散的速度加快多，使多酚更容易溶出。但是温度过高(大于60 ℃)时，会破坏多酚的结构，提取率急剧降低，这与任文霞等[24]的试验结果一致。因此，提取温度选择60 ℃最佳。

2.1.4 料液比对多酚得率的影响 由图5可知，随着溶剂用量的增大，新疆红肉苹果多酚得率呈现先上升后下降的趋势，当料液比为1∶4(g/mL)时，多酚得率最高。从提取效果与能源节省等方面综合考虑，溶剂的用量不宜过大。因此，料液比选择1∶4(g/mL)最佳。

图4 提取温度对多酚得率的影响

图5 料液比对多酚得率的影响

2.2 多酚提取工艺条件的响应面优化试验结果

按照1.3.4 的方法进行多酚提取条件的响应面优化试验，其试验因素与水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 响应面设计红肉苹果多酚提取试验的因子与水平

Table 1 The factors and levels in response surface design for polyphenol extraction of red-flesh apple

水平X1提取时间/minX2超声功率/WX3提取温度/℃X4料液比(g/mL)-110320501︰2020360601︰4130400701︰6

2.2.1 响应面回归模型的建立与分析 采用Design-Expert 8.0.5 软件分析4个因素(提取时间、超声功率、提取温度、料液比)对多酚得率的影响，建立的二次回归模型：

(2)

2.2.2 响应面模型分析因子间交互作用 图6(a)～(c)曲面相对比较陡，表明了超声功率与提取时间、提取温度与提取时间、提取时间与料液比之间的交互作用比较大，它们对多酚得率有一定影响，但不显著；图6(d)～(f)曲面相对比较平坦，说明提取温度与超声功率、料液比与超声功率、料液比与提取温度交互作用小，它们对多酚得率影响小。

从图6总的来看，提取时间与其他因素的交互作用对新疆红肉苹果多酚的影响最为显著。超声功率、提取温度和料液比的交互作用对新疆红肉苹果多酚的影响显著性不明显，表现为曲线平滑。

图6 试验各因素对多酚得率影响的响应面图

Table 2 Response surface experimental design and results for polyphenol extraction of red-flesh apple

序号X1X2X3X4Y多酚得率/(mg·g-1)1010-11．55820-10-11．556301101．5994-10101．685511001．5056-1-1001．4927-11001．468810101．705900-111．2781001-101．3671100-1-11．458120-1-101．47213-10011．428140-1011．737151-1001．6961601011．6951700111．602180-1101．71619-100-11．6942010-101．39921001-11．7352210011．58723100-11．66424-10-101．4812500002．1502600002．1192700002．1762800001．9982900002．187

2.2.3 最佳条件的确定以及回归模型的试验验证 利用Design-Expert 8.0.5 软件对回归模型进行预测和分析，得到的最佳工艺参数为：提取时间20.6 min，超声功率356.8 W，提取温度62.1 ℃，料液比1∶3.98(g/mL)，此时理论上多酚的最大得率为2.140 mg/g。

为了结合实际生产的需要，将超声波辅助提取新疆红肉苹果多酚的各个因素进行调整，即提取时间和温度分别为20 min、62 ℃，超声功率360 W、料液比1∶4 (g/mL)；在此调整后的条件下进行验证(5次平行实验)，结果多酚得率平均为2.135 mg/g，与理论预测值之间仅有0.2%的误差，证实本模型准确、有效。

苹果多酚易溶于有机溶剂，本试验采用乙醇作为提取溶剂，具有环保、无毒、安全等特点，并且还可回收利用，节省资源，这与贺金娜等[25]的研究方法一致。

表3 二次响应模型方差分析†

4 结论

(1) 试验以乙醇为溶剂通过Box-Behnken响应面优化并得到了提取新疆红肉苹果多酚的最佳工艺参数，在该条件下多酚的得率达到2.135 mg/g；试验获得的回归模型也可以准确分析和预测超声辅助提取新疆红肉苹果多酚的得率；说明该工艺实际可行。

(2) 试验发现超声辅助可以提高提取效率，但对多酚物质也有影响，还需要进一步探讨超声对其组成和生物活性影响的相关性，以切实为多酚的工业化生产和应用提供指导。

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Optimization on ultrasound-assisted extraction of polyphenols from red-flesh apple by response surface methodology

QI NaLIHanZHANGZhi-yuDENGHongHUYanGUOYu-rongMENGYong-hong

(CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

[Objective] Response surface methodology was used to optimize the extraction process condition of polyphenols from red-flesh apple with ultrasonic assistance. [Method] Using the red-flesh apple of XINJIANG as material, on the basis of single-factor experiment, four factors, inclouding extraction time, ultrasonic power, extraction temperature and ratio of material-to-liquid were chosed to design the experiment with response surface method. With Box-Behnken design and response surface analysis, the optimum extracting conditions of polyphenols from red-flesh apple were determined. [Result] The optimal process parameters of polyphenol extraction were determined and they were as follows: extraction time and temperature were 20 min and 62 ℃, ultrasound power and ratio of material-to-liquid was 360 W and 1∶4(g/mL) respectively. [Conclusion] The polyphenols yield was achieved to 2.135 mg/g for red-flesh apple of XINJIANG under theoptimized conditions. This result can provide a reference for the actual production of polyphenols.

red-flesh apple; polyphenol; ultrasound-assisted extraction

农业部苹果产业体系建设项目(编号：CARS-28)；中央高校科研业务专项经费项目(编号：GK201405005)

齐娜，女，陕西师范大学在读硕士研究生。

邓红(1967—)，女，陕西师范大学副教授，博士。

E-mail: hongden@snnu.edu.cn

2016-05-08