酶联免疫法测定水中氯霉素的方法探讨

2016-11-14董煜杰严义勇

供水技术 2016年5期

关键词：氯霉素冻干乙腈

刘静，董煜杰，严义勇

(1. 成都市自来水有限责任公司水质中心，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技术有限公司，广东深圳518000)

分析监测

酶联免疫法测定水中氯霉素的方法探讨

刘静1，董煜杰1，严义勇2

(1. 成都市自来水有限责任公司水质中心，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技术有限公司，广东深圳518000)

氯霉素药物在水产及畜牧业使用广泛，相关的行业用水及抗生素生产废水会在水域中残留，若被人体长期摄取，会造成被动的抗生素滥用，严重影响民众身体健康水平，因此水中氯霉素的检测需要引起重视。开发了一种针对水样品中氯霉素的快速检测方法。通过比较确定氮吹法为最优的前处理方法，并得到了较高的检测灵敏度(25 ng/L)。本研究为ELISA法在水质检测中的应用提供了一个范例，给水源污染应急检测提供一个快速检测方案。

酶联免疫法；氯霉素；冻干；氮吹

酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)自1971年建立以来，由于其极高的灵敏度、特异性及适用性，已成为生物及分析化学领域的前沿课题[1]。目前此法在医学、检测食品药物残留方面有广泛成熟的应用，而在水质检测中报导较少。形成这种情况的重要原因之一是ELISA研发过程中的样品处理方式不适用于水质样本检测。

氯霉素属广谱类抗生素药物，能抑制尤其是革兰氏阴性菌细菌蛋白质的合成，对各种立克氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用[2]。目前氯霉素类药物在水产和畜禽养殖中仍应用广泛，添加氯霉素的水产养殖水和抗生素制药厂偷排的废水是环境中氯霉素的来源。因此氯霉素的环境污染，尤其是水域中的污染是值得重视的问题[3]。目前检测氯霉素方法包括高效液相色谱法[4-5]、气相色谱法[6]、质谱法[7-9]等，其分析时间长、样品前处理复杂、需要昂贵的仪器且对操作人员技能有很高的要求。

本文将探索酶联免疫法如何与适合的样品前处理技术结合，以氯霉素(Chloramphenicol)为目标物，测定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有极高的特异性、准确度和灵敏度，还具有检测速度快、同时检测大量样本、方便易用的特点。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：氯霉素标准溶液100 μg/mL(甲醇溶剂，国家标准物质中心)、乙腈(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，Milli-P超纯水，氯霉素检测试剂盒(深圳市易瑞生物技术有限公司)。

仪器：Thermo Multiskan FC 96孔酶标仪(配备450和630 nm滤光片)；Eppendorf 5702离心机(转速4 000 r/min)；Denver Instrument 天平(感量0.00 001 g)；IKA MS3 basic涡旋仪；氮气吹干仪；Thermo finnpippete移液器：单道10～100 μL、100～1 000 μL、多道30～300 μL。

1.2 试验方法

1.2.1 准备

使用试剂盒前将试剂和微孔板回温至室温，用后放回2～8 ℃。取出需要数量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8 ℃。建议每个样品和标准液做2次平行试验。

1.2.2 加样

加入标准品/样品50 μL 到相应微孔，然后加入酶结合物50 μL 到每个微孔，最后加入抗体工作液50 μL 到每孔，轻轻震荡混匀后，盖上盖板膜。

1.2.3 孵育

室温25 ℃下避光反应30 min。

1.2.4 洗板

小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加1×洗涤液250 μL/孔，重复洗涤5 次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。

1.2.5 显色

每孔依次加入底物液A 50 μL，底物液B 50 μL，轻轻震荡混匀后，盖上盖板膜，25 ℃室温下避光反应15 min。

1.2.6 终止和读值

加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处(用双波长450/630 nm检测，在5 min内读完数据)，测定每孔OD值。

1.2.7 样品处理方法

取1 mL水样于1.5 mL离心管中；采样不同的富集方式进行浓缩；加入样本复溶液0.2 mL，涡旋震荡5 min 后用于点样(样本稀释倍数为0.2 倍)。

1.3 计算方法

标准品和样品的平均吸光度值(平均OD值)除以零标准的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零标准为100%(最大吸光度值)，其他OD值为最大吸光度的百分数。

说起“现成品艺术”，很容易让人联想到马歇尔.杜尚的一系列作品，比如《自行车轮》、《泉》、《大玻璃》、《L.H.O.O.Q》等。但在理论家阿瑟.丹托(ArthurC Danto)的著作《艺术的终结》一书中，丹托并没有将杜尚的《泉》作为一件标志“艺术终结”的作品，而是选择了安迪.沃霍尔(Andy Warhol)的《布里洛盒子》。这两件作品看上去都跟现成品有关，为什么丹托不选择更早出现的《泉》呢？

式中B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0——0ppb标准溶液的平均吸光度值

校准曲线以log(标准品浓度)为横坐标，以Logit(B/B0)为纵坐标，构建线性回归方程。将样品的Logit(B/B0)值代入上述回归方程，求得的值乘以样本稀释倍数0.2，即为样本中氯霉素含量。

2 结果与分析

2.1 水中氯霉素的富集

2.1.1 富集方式的选择

水中痕量抗生素富集方法可以用冻干法或氮吹浓缩富集法。冻干法是取1mL水样品，冷冻成冰干燥过夜后再测定。

选取了新鲜制备的双蒸水作为阴性样本。通过在1mL阴性样本中添加不同量的氯霉素，对两种方法进行回收率对比实验，结果见表1。

表1 不同方法回收率测定

对比试验表明冻干法回收率略高于氮吹法。冻干法可很好地实现水溶液中氯霉素的富集，但操作时间过长(16 h以上)，且需要配备冻干机。氮吹浓缩时间较短，试验回收率也能满足回收率>70%的检测要求。本次选用氮吹浓缩进行水中氯霉素的富集。

2.1.2 富集用有机溶剂的选择

因水相对常用有机溶剂来说沸点较高，不易吹干，需通过往水中掺和有机溶剂形成低沸混合物的方法来有效降低水的沸点，从而提高氮吹浓缩时效。

根据氯霉素的溶解性、有机溶剂与水的互溶性、共沸物形成情况等因素，选定乙腈作为水中氯霉素浓缩富集的有机溶剂。

2.1.3 富集用有机溶剂与水比例的选择

1 mL水样品中添加不同含量乙腈对浓缩干燥时间有一定影响。在78 ℃加热， 1 mL水样品中添加1，3，5，7，9和11 mL的乙腈，干燥时间如下表2所示。随乙腈加量增加，干燥时间先降后升。当乙腈：水比例为9 ∶1时，所需时间最短，此时最接近乙腈-水共沸物(乙腈含量85%，共沸点76 ℃)[10]。故选用乙腈∶水(9 ∶1)作为富集用低沸混合溶剂。不同乙腈掺和量的样品干燥时间如表2所示。

表2 不同乙腈掺和量的样品干燥时间

2.2 试剂盒有效性复核

2.2.1 线性检测

配置0，25，100，400和1 600 ng/L的5点标准点，绘制标准曲线，标准曲线的R2值为0.993，线性较好，符合检测要求。氯霉素ELISA的标准曲线如图1所示。

图1 氯霉素ELISA的标准曲线

2.2.2 检出限

以超纯水为空白样品，测定6个空白样品的平均值，再加上3倍标准差，即为检测限。配置0，25，100，400，1 600 ng/L的5点标准曲线(R2=0.993)，计算由上表可知检测限为24.81 ng/L，与试剂盒检出限标识相符。

表3 ELISA试剂盒空白样品的测定及检测限的核定

2.3 实际样品测试

选取了具有代表性的5个出厂水和6个管网水点位的样本进行了实际样品检测。5个出厂水，分别编号为：CC1，CC2，CC3，CC4，CC5；6个管网水，分别编号为GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行测试3次，取平均值，测定结果如表4所示。

表4 ELISA法测定实际水样中氯霉素的测定结果

3 结论

① 通过优化选择，获得了水质样本ELISA检测前处理的合适方法。将进一步提高ELISA检测在水环境检测中的应用前景。

② 氮吹-ELISA法的建立应用，大大提高了检测时效，适合水质样品的快速筛查定量。该方法对控制水质安全，应对突发性安全事件等水质监控具有重要意义。

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