斑马鱼Abcc2介导微囊藻毒素解毒功能探究

陆　星　钟　山　何　力

（1. 中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223； 2. 武汉大学基础医学院遗传学系，武汉 430071）

斑马鱼Abcc2介导微囊藻毒素解毒功能探究

陆星1钟山2何力1

（1. 中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223； 2. 武汉大学基础医学院遗传学系，武汉 430071）

研究克隆了斑马鱼（Danio rerio） abcc2基因序列，探讨了其在微囊藻毒素（MC-LR）解毒中的潜在功能。结果表明：斑马鱼abcc2具有同哺乳动物ABCC2相似的介导荧光底物MCB外排的转运活性，MC-LR处理可显著诱导其在斑马鱼幼体中的转录表达； 过表达Abcc2蛋白能显著增强ZF4细胞和斑马鱼胚胎对MC-LR的耐受性； Abcc2作为MC-LR的主要耐受因子，在组织防御和有毒物质的排泄中起重要作用，但其解毒功能还不清楚。研究结果为进一步揭示鱼类抗MC-LR积累的分子机理及培育低MC-LR残留的养殖新品种提供理论基础。

斑马鱼；Abcc2；微囊藻毒素；解毒

ABC转运蛋白（ATP binding cassette transporter）是一类能利用ATP水解产生的能量，完成底物跨膜转运的大分子量膜蛋白。该家族成员众多，在进化中高度保守，存在于从原核生物到哺乳动物的所有生物体中。典型ABC转运蛋白的分子结构包括2个亲水性的核酸结合结构域（Nucleotide-binding domain，NBD）和2个疏水性的跨膜结构域（Transmembrane domain，TMD）［1］。目前在人类中已发现了49个ABC转运蛋白，根据他们的结构特征和系统进化关系可分为ABCA到ABCG7个亚族。ABCC2属于ABC转运蛋白超家族中的C类亚族成员，是一类有机阴离子转运蛋白，能排出II相解毒反应的产物（还原型谷胱甘肽GSH、葡萄苷酸、硫酸酯和甘氨酸等的结合物），在细胞对多种有毒物质的解毒和排泄中具有重要作用。

藻毒素（Microcystins，MCs）是淡水系统中最常见的一类具有生物活性的七肽单环肝毒素。迄今为止，已鉴定出80多种不同结构类型的藻毒素且大多数都具有毒性［2］。微囊藻（Microcystin-LR，MCLR）是其中一种最常见、产量最多及危害最大的毒素，其毒性靶器官主要是肝脏。研究表明慢性暴露会使肝脏充血肿大，严重时直接导致肝出血［3］。目前比较受认可的致毒机理是游离的MC-LR进入细胞后，立即竞争性结合到磷酸酶的丝氨酸和苏氨酸亚基上，从而抑制其介导的下游级联信号，导致胞内活性氧的浓度升高［4］，打破蛋白磷酸化和脱磷酸化的平衡，最后致使肝细胞结构破化和肝功能发生紊乱，直至肝坏死［5］。

近年来，随着我国近海水域和内陆湖泊水体富营养化程度加重，导致有毒蓝藻水华暴发。这些蓝藻细胞破裂产生的藻毒素给人和动物的饮用水安全构成了严重威胁［6］。流行病学调查结果显示，我国东南沿海一些地区原发性肝癌与居民饮用水源中MC-LR的高本底含量密切相关［7］。斑马鱼由于其突出的优势，已在发育生物学、毒理学、遗传学和药理学等多学科的研究中得到广泛的应用［8］。研究表明斑马鱼Abcc2在重金属解毒和排泄中起重要作用［9］，但对MC-LR的解毒功能还没有报道。本实验克隆了斑马鱼abcc2基因的cDNA，构建了其表达载体，在细胞和胚胎水平研究了过表达斑马鱼Abcc2在MC-LR解毒中的潜在功能。

1　材料与方法

1.1材料

分析纯级的MC-LR（CAS#：101043-37-2）购自美国Aqua-Standard公司，用超纯水将MC-LR配成100 μg/mL的母液，用时稀释至所需浓度。MK571（CAS#：115104-28-4，Abcc2转运蛋白特异性抑制剂）、脂肪醇聚氧乙烯烷基醚磺基琥珀酸二钠盐（Monochlorobimane，MCB）、噻唑蓝（MTT）、曲拉通X-100（Triton X-100）和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2斑马鱼的饲养与MC-LR的暴露

AB系斑马鱼饲养于室内恒温循环水养殖系统中（水温28.5℃，pH=7.0±0.5），用孵化的卤虫幼体和红线虫分别投喂。按照以受精后小时数（hpf）表示胚胎的各个发育阶段。为收集整体原位杂交的材料，12 hpf以后的胚胎用含0.003%苯基硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）的培养液培养，防止色素沉积。

为检测低剂量MC-LR暴露对斑马鱼胚胎abcc2基因转录表达的诱导效应，将24 hpf的斑马鱼胚胎用0.01 μg/L MC-LR处理至120 hpf，收集96和120 hpf的胚胎样品。每个处理组用100枚胚胎，每隔12h将含MC-LR的胚胎培养液更换一次，处理过程中没有发现胚胎死亡和其他非致死效应，各实验独立重复3次以上。

1.3RNA提取、反转录和荧光定量PCR（qPCR）分析

收集的斑马鱼胚胎样品用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，用紫外分光光度计（Biophotometer Eppendorf）检测RNA的质量，按照Fermentas RevertAidTMFirst试剂盒的操作说明书进行cDNA第一链的合成。

使用Bio-rad公司生产的SYBR Green Mixture试剂和CFX Connect实时定量PCR检测系统进行qPCR分析。根据GenBank核苷酸数据库（NM_200589）的预测序列设计斑马鱼abcc2基因的定量PCR引物（采用Primer Premier 6.0软件设计）；研究表明用不同的化学物质处理24—120 hpf斑马鱼胚胎不会影响β-actin基因的表达［10］，因此，本研究选用β-actin作为检测MC-LR对abcc2诱导表达的内参，引物序列见表1。PCR反应体系：2×SYBER Green Master Mix 10 μL，2 μmol/L正、反向引物各1 μL，10倍稀释的cDNA样品1 μL，超纯水补足至20 μL。qPCR反应程序：95℃，30s；（95℃，10s；60℃，30s），40个循环；然后每个循环增加1℃，从65℃升高到95℃进行溶解曲线分析，各组反应都重复3次。采用ΔΔCt方法计算MC-LR对abcc2基因表达的诱导率，诱导效率=2-ΔΔCt。

1.4斑马鱼 abcc 2基因cDNA克隆和表达载体构建

从GenBank搜寻斑马鱼abcc2 mRNA序列（登录号见1.3），根据该序列设计正向引物abcc2-F1和反向引物abcc2-R1（表1），同时在正向引物引入Korzak序列以提高abcc2 cDNA的表达。PCR产物经凝胶回收后与表达载体pT2/CMV连接，构建表达载体pT2/CMV-Abcc2-Flag（C末端引入了Flag标签序列）。用引物GFP-F/R（表1）将pEGFP-F载体上的GFP编码区亚克隆到pT2/CMV相应位点，构建pT2/CMV-GFP。

1.5整体原位杂交

用引物abcc2-F2/R2扩增斑马鱼abcc2 cDNA，得到533 bp片段。将PCR产物用SalⅠ和NotⅠ酶切后插入pBluescript SK载体相应位点。将构建好的质粒模板单酶切线性化后，分别用T7和T3 RNA聚合酶合成掺入地高辛标记UTP的反义和正义RNA探针。按照Thisse等的方法［11］进行胚胎整体原位杂交和拍照。

表1　本研究所用的引物序列Tab. 1　Primers used in this study

1.6细胞培养和转染

ZF4细胞按照文献报道的方法培养［12］。简要地，转染前24h将细胞按照1×105/孔的密度种于24孔板。用X-tremeGENE HP转染试剂（Roche）转染细胞，转染后24h更换细胞培养基和进行后续实验。

1.7Western blot

Western blot实验方法参照文献［13］，Flag标签鼠源单克隆抗体和内参照β-Actin抗体均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.8荧光底物积累试验

用ABCC家族特异性的荧光底物MCB和其抑制剂MK571检测过表达斑马鱼Abcc2在ZF4细胞中的转运活性。实验前将表达载体pT2/CMV-GFP和pT2/CMV-Abcc2-Flag按照1.6所述方法转染ZF4细胞，24h后小心吸尽原来的培养基，加入0.5 mL含25 μmol/L MCB的培养基（同时添加或不添加25 μmol/L MK571），并迅速放入28℃培养箱孵育1h，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞清洗两遍，然后用0.1% Triton X-100/PBS（250 μL/孔）裂解细胞。用酶标仪（SpectraMax M2，USA）在激发光波长595 nm和发射光波长530 nm条件下测定荧光值。

1.9细胞毒性实验

MTT法检测MC-LR处理条件下细胞的成活率［14］。简要地，处理前24h将瞬时转染GFP和斑马鱼Abcc2的ZF4细胞按2×104细胞/孔的密度种于96孔板。MC-LR处理12h后，每孔加入10 μL MTT，并迅速放入37 ℃培养箱孵育3h，然后彻底吸尽培养基，每孔加入100 μL DMSO溶解活细胞内形成的蓝紫色甲瓒结晶，充分震荡后用酶标仪在550 nm波长测定吸光值。细胞的成活率表示为相应对照组吸光值的百分比，各实验至少独立重复3次以上。

1.10显微注射和急性毒性试验

参照Lu等［15］的方法，将表达载体pT2/CMVAbcc2-Flag通过显微注射仪导入斑马鱼单细胞期胚胎中，同时用注射pT2/CMV-GFP的胚胎作对照。各质粒注射量均为150 pg/卵。

24 hpf时挑选显微注射后表型正常的胚胎进行MC-LR急性毒性实验。毒性实验在60 mm细胞培养皿中进行，各实验都独立重复3次，每次用180枚胚胎，随机分成60枚/盘，从24 hpf开始，将胚胎分别暴露于含MC-LR的胚胎培养液中直至120 hpf。按照没有心跳和血流、对刺激无反应等标准判定胚胎的死亡。每隔12h更换一次溶液，将死亡的胚胎挑出，实验结束时计算累计的胚胎死亡率。

1.11统计分析

采用SPSS 15.0统计软件中的Student's t test进行差异显著性分析（**表示P＜0.01，*表示P＜0.05）。

2　结果

2.1MC-LR 对斑马鱼abcc 2 mRNA的诱导表达

首先，用0.01 μg/L MC-LR处理24 hpf斑马鱼胚胎至120 hpf，分别收集96 hpf和120 hpf胚胎样品进行荧光定量 PCR分析，检测MC-LR对斑马鱼abcc2 mRNA的诱导效应。如图1A结果显示，0.01 μg/L MC-LR暴露能显著诱导96和120 hpf斑马鱼幼体abcc2基因的转录表达，诱导效率分别为1.5和1.7倍。整体原位杂交结果表明（图1B），与对照组（CK）相比，0.01 μg/L MC-LR暴露能显著诱导abcc2基因在96和120 hpf斑马鱼幼体肠道中的表达。

图1　MC-LR对斑马鱼胚胎abcc2基因转录水平表达的诱导效应Fig. 1　The role of MC-LR in the expression of zebrafish embryos abcc2 gene

2.2重组载体pT2/CMV-Abcc2-Flag表达活性的鉴定及转运功能的分析

将构建体pT2/CMV-Abcc2-Flag和pT2/CMVGFP转染斑马鱼ZF4细胞，利用Western blot检测目标蛋白的表达。如图2A结果所示，CMV启动子驱动的斑马鱼Abcc2能够在ZF4细胞中有效表达。其次，用荧光底物积累试验检测过表达Abcc2在ZF4细胞中对MCB的转运活性。结果表明（图2B），MCB在过表达Abcc2 ZF4细胞中的含量显著低于过表达GFP的细胞。当加入抑制剂MK571后，Abcc2的转运功能被阻遏，MCB在ZF4中的积累量显著增加（P＜0.05）。

2.3过表达斑马鱼Abcc2增强了ZF4细胞对MCLR的耐受性

将瞬时转染表达载体pT2/CMV-GFP和pT2/ CMV-Abcc2-Flag的ZF4细胞分别暴露于含不同浓度MC-LR（0—50 μg/mL）的培养液中，孵育12h后MTT法检测细胞的成活率。如图3结果显示，过表达Abcc2细胞的成活率显著高于过表达GFP的细胞（P＜0.01），当MC-LR暴露的浓度为50 μg/mL时，过表达Abcc2细胞的成活率相比GFP对照组提高了5.27倍。

2.4过表达斑马鱼 Abcc2 降低了 MC-LR 对斑马鱼胚胎的毒性

进一步在胚胎水平检测了过表达斑马鱼Abcc2对MC-LR解毒的分子功能。研究表明50 μg/L MCLR能够将40%囊胚形成期（Blastula stage）的斑马鱼胚胎或者发育至晚期的幼体杀死［16］。因此，选用50 μg/L MC-LR对24—120 hpf斑马鱼胚胎进行急性毒性试验，检测过表达Abcc2介导斑马鱼胚胎在96和120 hpf抵御MC-LR胁迫的毒性效应。如图4结果显示，在96和120 hpf，过表达Abcc2胚胎的死亡率都显著低于过表达GFP的胚胎（P＜0.05），说明过表达Abcc2也增强了斑马鱼胚胎对MC-LR的耐受性。

图2　斑马鱼Abcc2在ZF4细胞中的表达及对MCB转运活性的分析Fig. 2　The expression of Zebrafish Abcc2 and its role in transport of MCB in ZF4 cells

图3　过表达Abcc2增强了ZF4细胞对MC-LR的耐受性Fig. 3　Overexpression of Abcc2 protected ZF4 cells from acute toxicity of MC-LR

图4　过表达Abcc2降低了MC-LR对斑马鱼胚胎的毒性Fig. 4　Overexpression of Abcc2 decreased toxic effects of MCLR on zebrafish embryos

3　讨论

3.1Abcc2转运蛋白具有介导鱼类多毒物耐受性的功能

藻毒素的产生主要是因为含有氮和磷等营养物质的生活污水或工业废弃物排放入湖泊和河流中，进而改变了水体的生态结构和平衡，导致某些藻类尤其是蓝藻的异常增殖。在适宜的温度和一定的光照条件下，就会出现严重的蓝藻水华现象［17］。蓝藻细胞破裂释放的藻毒素在环境中极难被降解从而在水体中大量积聚，严重破坏了水生态系统的平衡［18］，也给水产养殖带来了严重的经济损失［19］。另外，人类某些疾病，例如肠胃炎、原发性肝癌及其他一些过敏原性反应都直接或间接与藻毒素的慢性暴露相关［20］。为了抵抗这种毒物的毒性，水生动物包括鱼类在长期的进化过程中形成了有效的防御机制。Abcc2转运蛋白是鱼类多毒物耐受性机制中的主要因子之一，在Hg、Cd和Pb等重金属的解毒和排泄中具有重要作用［9］。但其在MC-LR的解毒功能还未被研究，本实验在ZF4细胞和胚胎上采用过表达的方式研究了斑马鱼Abcc2对MCLR解毒的分子功能。

3.2斑马鱼Abcc2的结构和功能具有高度保守性

一系列实验结果表明斑马鱼Abcc2在脊椎动物进化过程中是高度保守的。首先，在分子结构上高度保守，包含人ABCC2所有的功能域和关键基序，是人ABCC2基因的直系同源基因。其次，斑马鱼Abcc2能够有效介导ZF4细胞对荧光底物MCB的外排，且其转运活性能被ABCC家族特异性的抑制剂MK571阻遏。第三，过表达斑马鱼Abcc2能够显著增强ZF4细胞和斑马鱼胚胎对MC-LR的耐受性。

3.3斑马鱼Abcc2及其他家族成员在MC-LR解毒和排泄中的潜在功能

本研究结果显示0.01 μg/L MC-LR暴露能够明显诱导96和120 hpf斑马鱼胚胎abcc2 mRNA的上调表达，并在肠道中也检测到其转录本的高表达，这表明斑马鱼Abcc2可能是胚胎早期发育过程中抵御环境毒物吸收和排泄的重要解毒因子。但不排除ABC其他家族成员也参与对MC-LR解毒和排泄，首先MC-LR对96和120 hpf斑马鱼胚胎abcc2基因的诱导效率分别只有1.5和1.7倍。其次，谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）催化合成的谷胱甘肽（GSH）能显著降低藻毒素在鱼体内的积聚［21］，GSH被认为是细胞内II相解毒产物，通过与游离的有毒物质结合形成可溶性复合体即GS-X，可作为ABCC转运蛋白的高亲和性底物而被排出胞外［22］。此外，有报道表明MCLR能显著诱导多齿任氏鳉（Jenynsia multidentata）鳃中abcb4基因3倍左右的上调表达［2］，而鳃又是机体与环境有毒物质接触的主要生理屏障，说明Abcb4在限制MC-LR的吸收和排泄中也发挥着重要功能。

综上所述，本研究已经证实了过表达斑马鱼Abcc2能增强ZF4细胞和斑马鱼胚胎对MC-LR的耐受能力，说明其具有同哺乳动物ABCC2相似的功能—介导多毒物耐受机制（Multi-xenobiotic resistance，MXR），进而抵御毒物对细胞和组织的毒性效应。由于MC-LR是环境水体中广泛分布的蓝藻水华污染物，因此还需更深层次去揭示水生生物ABC转运蛋白对MC-LR解毒和排泄的分子机制。

致谢：

感谢中国科学院水生生物研究所崔宗斌研究员课题组提供的实验材料和技术支持。

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PRELIMINARY STUDY ON THE ROLES OF ZEBRAFISH ABCC2 IN THE DETOXIFICATION OF MICROCYSTIN-LR

LU Xing1，ZHONG Shan2and HE Li1
（1. Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，China； 2. Department of Genetics，School of Basic Medical Science，Wuhan University，Wuhan 430071，China）

Eutrophication in aquatic environment caused the release of microcystin-LR（MC-LR） into a water body during a period of cyanobacterial blooms，which pose serious threat to the fish survival and public health. In this study，we cloned the cDNA sequence of zebrafish（Danio rerio） abcc2 gene，and explored its role in MC-LR detoxification. Our results showed that zebrafish abcc2，similar to its mammalian counterparts，played roles in transport of its fluorescent substrate MCB，and that MC-LR treatment induced its transcriptional expression. Overexpression of Abcc2 significantly improved the survival rates of ZF4 cells and zebrafish embryos exposed to MC-LR. Zebrafish Abcc2 mediates MC-LR resistance and tissue defense and toxicants excretion，but it's role the detoxification of MC-LR remains unclear. These data reveal molecular mechanisms of fish in preventing accumulation of MC-LR and provide theoretical fundamentals for breeding cultured fish strains with MC-LR-resistant ability.

Zebrafish； Abcc2； Microcystin-LR； Detoxification

Q344+.1

A

1000-3207（2016）05-0997-06

10.7541/2016.129

2015-12-23；

2016-01-21

国家农产品质量安全风险评估项目子课题（GJFP201501004）； 国家自然科学基金项目（31172395）资助 ［Supported by the Program for Risk Assessment of National Agri-products Quality and Safety（GJFP201501004） and the National Natural Science Foundation of China（31172395）］

陆星（1988—），男，湖北洪湖人； 博士，助理研究员； 主要研究方向为分子营养学。E-mail：luxing@yfi.ac.cn

钟山（1963—），男，湖北洪湖人； 博士，教授； 主要研究方向为遗传与发育生物学。E-mail：zhongshan@whu.edu.cn；

何力（1963—），男，湖北石首人； 博士，研究员； 主要研究方向为渔业资源与水产品安全。E-mail：Heli28@sohu.com