蓝藻的蛋白质翻译后修饰研究进展

杨明坤　林小煌，　马炎炎，　王　炎，　葛　峰

（1. 中国科学院水生生物研究所，藻类生物学重点实验室，武汉 430072； 2. 中国科学院大学，北京 100049）

蓝藻的蛋白质翻译后修饰研究进展

杨明坤1林小煌1，2马炎炎1，2王炎1，2葛峰1

（1. 中国科学院水生生物研究所，藻类生物学重点实验室，武汉 430072； 2. 中国科学院大学，北京 100049）

蛋白质翻译后修饰系统几乎参与了细胞所有的正常生命活动过程，并发挥着重要的调控作用。目前，基于生物质谱技术进行蛋白质翻译后修饰的规模化分析鉴定，已经成为蛋白质组学研究的核心内容之一。近年来的研究表明，蓝藻细胞中存在着复杂的蛋白质翻译后修饰系统，如磷酸化，乙酰化，甲基化，糖基化，氧化等，这些翻译后修饰在蓝藻细胞的代谢过程中可能发挥着重要的调控作用。本文主要针对蓝藻细胞中蛋白质翻译后修饰的发现与鉴定，以及翻译后修饰潜在的生物学功能展开简要综述。

蓝藻；蛋白质组学；翻译后修饰

蓝藻（Cyanobacteria），具有革兰氏阴性细菌相似的细胞结构，其细胞内含有大量叶绿素a和藻蓝素使得细胞呈蓝绿色，因此，蓝藻又被称为蓝细菌或蓝绿藻。蓝藻在地球上分布广泛，是最早出现的光合放氧生物，对地球表面从无氧环境变为有氧的大气环境发挥了关键性作用［1］。蓝藻结构简单，没有分化真正意义上的细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器，却具有类似于真核藻类和高等植物的光合作用系统，能够进行光解水放氧。蓝藻还具有固氮，氢代谢以及基于光合作用生［2］产生物燃料的能力，同时，在遗传学上又具有操作性强，构建突变体简单且周期短等优点，蓝藻已经成为研究光合作用和生物能源的重要模式生物之一。近年来的研究发现，蓝藻细胞中存在多种不同类型的蛋白质翻译后修饰，且这些修饰在蓝藻细胞的代谢过程中可能发挥着重要的调控作用。本文针对蓝藻细胞中蛋白质翻译后修饰的分析鉴定及其潜在的生物学功能展开简要综述，将有助于深入了解蓝藻的生长以及对环境变化的适应等，可为研究光合作用与开发藻类生物能源提供重要的理论依据。

1　蛋白质翻译后修饰

蛋白质是执行细胞功能的基本单元，其表达受基因组，表观遗传学和翻译后修饰等多个层次的调控。其中蛋白质翻译后修饰作为蛋白质功能调节的一种重要方式，在调控不同生物体的众多生物学过程中都发挥着重要的作用［2，3］。它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象、活性状态、亚细胞定位以及蛋白质-蛋白质相互作用等。翻译后修饰使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。据估计，人体内50%—90%的蛋白质发生了不同类型的翻译后修饰，包括肽链骨架的剪接，特定氨基酸侧链上添加新的基团以及对已有基团进行化学修饰等［4］。目前，记录在册的翻译后修饰达到几千种（http：//www. unimod.org/modifications_list.php？）（http：//www. abrf.org/index.cfm/dm.home），仍有新的翻译后修饰不断被发现。根据蛋白质翻译后修饰的专业数据库PhosphoSitePlus（http：//www.phosphosite.org）统计结果显示，研究较多的蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化和泛素化等［5］。由于蛋白质翻译后修饰发生在转录之后，因此基因组学方法无法实现翻译后修饰类型以及结构的检测。

近年来，随着生物质谱技术的进步和高效分离方法的发展，蛋白质组学技术为蛋白质翻译后修饰的系统分析提供了前所未有的发展契机，由此也派生出一门新的学科：修饰蛋白质组学［2，6］，它主要利用蛋白质组学分析技术对修饰蛋白质及其位点进行规模化分析鉴定，对修饰结构进行确认以及对不同生理状态下翻译后修饰的变化情况进行定量分析。然而，大多数发生翻译后修饰的蛋白质通常具有丰度低、动态范围宽以及结构复杂等特点； 同时，翻译后修饰存在“时空特异性”，即蛋白质的修饰类型与修饰程度随生物生存环境及内在状态的变化会表现出极大的差别，有的修饰甚至是转瞬即逝的，所以，蛋白质翻译后修饰的程度以及其生物学功能的挖掘还存在着极大的空间，对蛋白质翻译后修饰进行规模化分析也面临着巨大的挑战。

2　蓝藻的蛋白质翻译后修饰研究

近年来，越来越多的研究发现，蛋白质翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化，甲基化，糖基化，生物素化，氧化等，可能参与蓝藻的胁迫响应，能量代谢以及光合作用等一系列的细胞进程； 甚至在蓝藻的次级代谢产物中（如各种多肽），也发现存在糖基化，甲基化，酰基化等修饰，这些修饰可能具有调控次级代谢产物的功能，从而在抗菌、抗癌以及免疫活性抑制等方面发挥重要作用［7］。然而，目前对于蓝藻蛋白质翻译后修饰的功能研究仍然较少，尤其是翻译后修饰在蓝藻细胞中的分子调控机制仍有待于进一步的深入研究，以下将对目前蓝藻细胞中的蛋白质翻译后修饰研究进展进行讨论。

2.1磷酸化修饰

蓝藻能够耐受高低温、紫外线辐射、干旱和盐等胁迫，其细胞内复杂的信号转导系统起了非常重要的调控作用。它能够使蓝藻非常迅速的感受外界环境的信号变化，通过调控基因的表达，使细胞对外界环境作出积极快速的响应，从而使蓝藻在各种极端环境中得以生存下来。目前，蓝藻的信号转导系统主要有二元信号传导系统，类似于真核的丝氨酸/苏氨酸激酶系统（Serine/threonine protein kinase，STK）以及近年来发现的酪氨酸激酶/磷酸酶（Tyrosine kinase/tyrosine phosphatase）系统［8］。随着蓝藻全基因组测序工作的完成，蓝藻细胞中磷酸化修饰介导的信号转导系统也受到越来越多的关注。通过基因组分析发现，在集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7002中均含有12个预测的STK序列，集胞藻PCC 6803含有7个相关的磷酸酶，聚球藻PCC 7002中含有6个相关的磷酸酶［9—11］，而在鱼腥藻PCC 7120中则含有多达52个预测的STK序列和12个相关的磷酸酶［12］。此外，还在蓝藻中发现有少量预测的酪氨酸激酶/磷酸酶序列［8］。这些激酶/磷酸酶介导的可逆磷酸化修饰系统，在细胞感受外界刺激以及作出适应的应答过程中起着至关重要的调控作用［13］。发现并鉴定这些激酶/磷酸酶的作用底物以及验证其在信号网络中的作用，将有助于更加深入全面的理解磷酸化修饰介导的蓝藻信号转导网络。

早在1984年，Schuster等［14］就运用32P标记技术，首次在藻细胞Calothrix sp. PCC 7601中发现了磷酸化修饰蛋白质。基于该方法，在Synechococcas sp. PCC 6301［15］，Anabaena sp. PCC 7120［16］，Synechocystis sp. PCC 6803［17，18］，Synecbococcus sp. PCC 7942［19］等藻株中均鉴定到磷酸化修饰蛋白质的存在。进一步研究表明，藻胆蛋白复合物磷酸化修饰有助于藻胆体的组装，而在高光与缺氮条件下，藻胆蛋白复合物会发生去磷酸化修饰，从而导致藻胆体发生解聚，使细胞免受光损伤［20，21］。研究发现，KaiC蛋白则可以通过自磷酸化与去磷酸作用调控其自身活性，从而调节蓝藻细胞的生物钟［22］。此外，磷酸化修饰还可能参与了蓝藻的碳源/氮源利用调控，高光适应，状态转换以及盐胁迫等一系列的过程［8，20］。虽然在蓝藻中已经发现一些磷酸化蛋白可能参与多种代谢调控途径，但仍然只有较少的磷酸化蛋白被鉴定，且具体的磷酸化修饰位点也仍然未知，这严重阻碍了蓝藻细胞中磷酸化修饰的分子调控作用机制的研究。

随着修饰蛋白质组学技术的日趋成熟，使利用高通量质谱技术鉴定蓝藻细胞中磷酸化修饰蛋白及其位点成为可能。作者首次利用目前比较成熟的磷酸化肽段富集技术-TiO2富集技术，对一株极端耐盐、耐高光的模式蓝藻-聚球藻PCC 7002进行磷酸化肽段富集，并结合高通量质谱技术，鉴定到245个磷酸化蛋白，其中较多磷酸化蛋白参与了二元信号转导通路以及光合作用通路，包括光合系统Ⅰ，光合系统Ⅱ，藻胆体以及细胞色素复合物等［23］。而在另一株模式蓝藻中-集胞藻PCC 6803，同样鉴定到较多的磷酸化蛋白。Mikkat等［24］首次结合双向电泳技术与MALDI-TOF MS/MS质谱技术，从高盐和低盐培养的集胞藻PCC 6803中鉴定到32个磷酸化蛋白。由于磷酸化蛋白及其修饰位点鉴定数目仍然较少，Spät等［25］则结合磷酸化肽段富集与高通量质谱技术，系统地分析了集胞藻PCC 6803中的磷酸化蛋白，共鉴定到202个磷酸化蛋白，并通过二甲基化定量标记方法，对藻细胞在缺氮条件下的蛋白表达水平进行了分析，最终定量到了2111个蛋白，其中包含148个磷酸化蛋白； 研究结果显示，藻细胞缺氮条件处理24h后，细胞内磷酸化修饰水平显著提高，包括PII信号蛋白，碳/氮代谢途径以及光合作用途径中的相关蛋白，表明磷酸化修饰在藻细胞应对环境刺激方面具有重要的调控作用。同年，Lee等［26］也报道了集胞藻PCC 6803中的磷酸化蛋白，不同的是，该研究对膜蛋白的磷酸化修饰进行了分析，共鉴定到33个磷酸化蛋白，其中11个为具有跨膜结构的磷酸化膜蛋白。作者通过对集胞藻PCC 6803中磷酸化蛋白研究发现，较多蛋白参与了能量代谢与光合作用途径，进一步功能研究显示，磷酸化修饰参与调控了蓝藻的光能吸收与传递过程［27］。

磷酸化修饰作为一种快速的应激调控方式，在调控蓝藻细胞适应环境胁迫方面起着重要作用。越来越多磷酸化蛋白及其修饰位点的发现，将为全面深入研究磷酸化修饰调控蓝藻细胞胁迫响应的分子作用机制提供新的理论依据与研究思路。

2.2乙酰化修饰

蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰与磷酸化修饰一样，在生物体内广泛存在，是一种可逆、保守且高度调控的翻译后修饰，参与调控代谢、转录活性、蛋白质稳定性、信号通路及病原微生物的感染等众多重要的生理功能［28—30］。乙酰化修饰能够中和蛋白分子带正电荷的赖氨酸残基，从而改变蛋白的物理、化学性质，实现对蛋白功能的调节［31，32］。最初的研究主要集中在染色体组蛋白的乙酰化修饰上，它能中和组蛋白赖氨酸残基的正电荷，使其与DNA 的结合松散而利于基因的转录，调控基因表达水平［33］。因此，乙酰化修饰对表观遗传学有着深远影响。近年来随着研究的深入，发现很多非组蛋白也可进行乙酰化修饰调节，由此开拓出以非组蛋白为底物的蛋白质乙酰化修饰研究领域。随后的研究表明，细胞内几乎所有的代谢酶都可以被乙酰化修饰，该修饰广泛参与到整个细胞最基础的生命代谢活动中，对细胞内的各类代谢通路进行精确的调节与控制（图1）［34，35］。

图1　乙酰化修饰广泛调控细胞代谢过程［35］Fig. 1　Acetylation regulation of metabolic processes

在原核生物中，最早由Zhang等［36］利用乙酰化肽段富集技术，结合高通量的nano-HPLC/MS/MS技术，在大肠杆菌中首次大规模鉴定到91个乙酰化蛋白。高通量乙酰化蛋白质组学的关键就在于乙酰化肽段富集技术，通常只有亲和性较高的泛乙酰化修饰抗体，才能有效的富集到细胞中含量较低的乙酰化修饰肽段。由于高质量抗体的缺乏，严重阻碍了乙酰化蛋白质组学的发展。2013年，Zhang等［37］改进了乙酰化修饰抗体的制备策略，获得了高效的乙酰化修饰抗体，最终在大肠杆菌中鉴定到了349个乙酰化蛋白的1070个乙酰化修饰位点。之后，在枯草芽孢杆菌［38］，鼠伤寒沙门氏菌［39］，炽热芽孢杆菌［40］以及结核分枝杆菌［41］等一系列原核生物中，均鉴定到较多乙酰化蛋白及其修饰位点。随着更多乙酰化蛋白的鉴定，该修饰的调控作用也逐渐被揭示，其中最主要的作用就是参与代谢调控，如糖酵解，TCA循环，磷酸戊糖途径、氨基酸代谢以及脂肪酸代谢等。研究发现，乙酰化修饰甚至可以调控致病相关蛋白的免疫原性，影响病原菌的致病性。这些研究揭示了乙酰化修饰在调控能量代谢过程以及影响病原菌致病性等方面的重要作用。

在蓝藻的光合系统复合物中，已经发现铁硫蛋白Pet，细胞色素蛋白PsbF以及光系统Ⅱ蛋白PsbJ都存在乙酰化修饰［42，43］。此外，在蓝藻的次级代谢产物中，同样发现部分肽段或是藻毒素被乙酰化修饰［44—46］。作者结合乙酰化肽段富集与高通量nano-HPLC/MS/MS技术，首次系统地分析了蓝藻细胞中的乙酰化修饰水平，在集胞藻PCC 6803中鉴定到513个乙酰化蛋白及其776个修饰位点，生物信息学分析结果显示，大多数乙酰化蛋白参与了藻细胞的能量代谢过程，并首次发现了31个被乙酰化修饰的光合作用相关蛋白与16个碳固定途径相关蛋白，该研究揭示了乙酰化修饰可能参与调控蓝藻的光合作用途径［47］。在另外一株蓝藻-聚球藻PCC 7002中，作者同样鉴定到较多乙酰化蛋白，进一步的功能研究结果显示，可逆的乙酰化修饰不仅能够调控光能吸收与传递效率，还能通过影响光合作用相关蛋白结构，进而影响光合作用复合物的组装，显著降低光合作用效率（未发表）。综上结果，乙酰化修饰不仅能够调控代谢酶活性，还能通过改变蛋白结构，影响蛋白的功能，从而参与蓝藻细胞内的光合作用调控过程。

蛋白质乙酰化与去乙酰化修饰是一种精细的调节过程，由乙酰转移酶和去乙酰化酶对蛋白质赖氨酸上的一个或多个位点进行乙酰化和去乙酰化修饰，从而改变蛋白的结构与功能，对细胞内众多代谢相关通路进行精确的调节与控制。随着蛋白质乙酰化修饰研究的深入，其参与调控的代谢途径及其重要性也倍受关注。在真核生物中，乙酰转移酶与去乙酰化酶的功能研究较多，两种酶介导的乙酰化和去乙酰化反应，能够影响细胞的多种代谢网络［48—51］。在原核生物中，Starai等［52］在沙门氏菌中首次发现了乙酰转移酶（Protein acetyltransferase，简称Pat），它能够调节中心代谢酶-乙酰辅酶A合成酶活性，进而调控细胞的代谢网络。而具有去乙酰化酶活性的蛋白CobB（NAD+-dependent deacetylase，简称CobB）最早被用于ADP-核糖基转移酶的功能研究［53］。2002年，Starai等［54］在鼠伤寒沙门氏菌中发现乙酰辅酶A合成酶的609位赖氨酸残基的乙酰化被CobB去掉后，能够激活其酶活性，从而首次报道了原核生物的去乙酰化酶。随后以Pat、CobB作为乙酰转移酶和去乙酰化酶展开了一系列的研究，揭示了两种酶催化底物的作用机制［55—57］。作者通过比对分析发现，在聚球藻PCC 7002中含有16个预测的乙酰转移酶基因以及4个去乙酰化酶基因，在集胞藻PCC 6803中也含有10个预测的乙酰转移酶基因以及2个去乙酰化酶基因，这些乙酰转移酶和去乙酰化酶可能通过改变底物蛋白的乙酰化修饰水平，从而对代谢以及光合作用途径进行精细调控。然而，迄今为止，在蓝藻中还未见到乙酰转移酶和去乙酰化酶的相关研究报道，其所催化的底物蛋白在光合代谢中的调控机理也还没有被揭示，均有待于进一步的深入研究。

2.3其他修饰类型

在蓝藻细胞中，还存在许多其他不同种类的蛋白质翻译后修饰，对藻细胞的生长，代谢等过程进行精细调控，如氧化修饰，糖基化修饰等。

光合生物能够适应光合放氧与呼吸作用所产生的活性氧，主要依赖于其胞内复杂的抗氧化防御系统，而在大多数生物中，还原型谷胱甘肽介导的抗氧化起着具有非常重要的作用［58］。谷胱甘肽通过巯基与蛋白中半胱氨酸的自由巯基结合，形成蛋白的谷胱甘肽修饰［59，60］，当细胞受到氧化胁迫或亚硝化胁迫时，可逆的谷胱甘肽修饰能够起到保护蛋白以及调控蛋白活性的作用［59，61］。在聚球藻PCC 6803中，也发现谷胱甘肽修饰能够调控蛋白活性［62，63］。Chardonnet等［64］就利用高通量蛋白质组学方法，在集胞藻PCC 6803中发现了383个谷胱甘肽修饰的蛋白质，这些蛋白广泛参了到碳/氮代谢，细胞分裂，胁迫响应以及H2代谢等过程。除了谷胱甘肽修饰，在蛋白的半胱氨酸上还存在其他重要的翻译后修饰，如巯基氧化修饰，Guo等［65］通过化学方法标记已发生氧化修饰的半胱氨酸，再针对标记的化学基团进行特异性的富集，最终，鉴定并定量到1350个半胱氨酸的巯基氧化修饰。

糖基化修饰也是较早被发现的翻译后修饰之一，一直认为只有真核生物中才存在，直到在嗜盐杆菌Halobacterium salinarium的膜组分中也发现糖基化修饰［66］，该修饰在原核生物（尤其是病原菌）中的作用也相继被揭示，而糖基化修饰的蛋白大多数属于纤毛蛋白，在调控细胞毒力以及细菌与宿主细胞黏着方面起着重要作用［67—71］。2004年，Kim等［72］首次在蓝藻中发现了纤毛蛋白可能存在不同类型的翻译后修饰，这些修饰可能影响到纤毛的组装，其中就包括纤毛蛋白中的O连接的糖基化修饰，该修饰可能与藻细胞的趋向运动有关［73］。此外，Kim等［74］还发现了另外一种重要纤毛蛋白修饰-三甲基化修饰，他们利用超高分辨率质谱（FTICR）MS，成功鉴定到纤毛蛋白PiliA的三甲基化修饰以及二甲基化、单甲基化修饰。已知三甲基化修饰（ΔM=42.0106 Da）是一种分子量与乙酰化修饰（ΔM=42.0470 Da）非常接近的翻译后修饰，对于分辨率较低的质谱，往往无法区分0.03 Da的误差。Kim等［74］不仅鉴定到纤毛蛋白三甲基化修饰，还通过修饰位点的定点突变实验分析发现，三甲基化修饰能够通过调控纤毛蛋白的功能，进而影响细胞的趋向运动。

此外，在蓝藻细胞中，还发现存在甲基化［75，76］、过硫化［77，78］、ADP-核糖基化［79］、脂酰基化［80］、异戊二烯化［81］、棕榈酰化［82］等不同的翻译后修饰，这些修饰可能在蓝藻细胞的代谢与光合作用等过程中可能发挥着不同的调控作用。

3　蓝藻蛋白质翻译后修饰的大规模发现

图2　蛋白质翻译后修饰分析策略Fig. 2　Strategies of proteomic analysis of post-translational modifications

虽然利用高通量蛋白质组学技术，已经发现了一些不同类型的蛋白质翻译后修饰，但由于修饰蛋白质的不均一性以及相对丰度低的特性，使得蛋白质翻译后修饰的大规模分析鉴定仍存在困难。目前，对复杂生物样品中修饰蛋白质和肽段主要采用选择性富集的策略，来实现修饰蛋白质组学的规模化鉴定（图2），如技术路线最成熟的富集策略-基于TiO2等化学材料富集的磷酸化蛋白质组学和基于乙酰化修饰抗体富集的乙酰化蛋白质组学。然而，还存在许多不同类型的翻译后修饰并没有很好的富集策略，无法实现大规模鉴定。作者研究团队利用近年来兴起的一个新的技术手段-蛋白质基因组学（蛋基组学，Proteogenomics）技术，不经过样品富集，在聚球藻PCC 7002中，首次大规模鉴定到23种不同的蛋白质翻译后修饰。

蛋基组学，就是利用蛋白质组学数据，结合基因组与转录组数据对基因组进行注释。最先由Jaffe等［83］于2004年首次提出，作者采用高通量质谱数据匹配基因组直接翻译得到蛋白序列的方法，在仅有810 kb大小的细菌基因组上直接鉴定开放阅读框（open reading frame，ORF），通过此方法，作者对原有基因组信息进行了验证与补充，并修订了约10%的ORF。随着蛋白质组学技术手段日益成熟，高灵敏度、高精度的质谱仪使得完全覆盖蛋白质组也成为可能，如人类蛋白质组数据中84%的蛋白已被鉴定到［84，85］，因此，蛋白质组数据不仅可以实现对基因组序列的重新注释、发现新基因，还能系统发现蛋白质特有的翻译后事件（如翻译后修饰和信号肽等）。

作者利用蛋基组学方法，对集胞藻PCC 7002进行了基因组的重注释以及翻译后修饰的大规模鉴定。收集了不同生长时期与代谢状态的藻细胞，提取总蛋白并分离出膜组分与胞浆组分，采用Trypsin/ Glu-C蛋白酶进行酶切以获得较高覆盖度的肽段序列； 再利用C18填料的固相萃取柱或阳离子交换柱对获得的肽段进行分离，降低肽段的复杂程度； 最后使用超高分辨率的质谱LTQ-Orbitrap Elite对肽段进行分析。虽然样品中翻译后修饰蛋白丰度较低，但采用了多重方法对样品进行了处理，很大程度降低了样品的复杂程度，即使在未经过任何形式的翻译后修饰富集的情况下，仍能鉴定到较多翻译后修饰蛋白质。利用非限制性检索算法-即数据库检索时不设定任何修饰类型，对样品中的翻译后修饰进行非限制性检索，主要采用非限制性蛋白质翻译后修饰检索引擎-MODa（MODaification via alignment）对样品进行分析，最终鉴定到690个蛋白含有不同的翻译后修饰。为了更精确定位翻译后修饰及其对应的修饰位点，采用了MaxQuant算法，对感兴趣的翻译后修饰进一步验证，最终大规模鉴定到了23种不同的翻译后修饰，其中绝大多数修饰是首次在蓝藻中发现。进一步研究表明，参与蓝藻光合作用的大多数蛋白具有复杂的翻译后修饰，在不同的生长和处理条件下会发生动态变化，提示这些修饰在光合系统中起着重要的调控作用（图3）［86］。

4　结论与展望

研究蓝藻中蛋白质翻译后修饰的种类、结构、机制以及生物学功能，将使我们对蓝藻蛋白质各种特性有进一步的了解，并为我们全面深入理解蓝藻细胞生命活动的调控机制提供必要的信息。然而，蛋白质翻译后修饰的大规模发现及其功能研究仍存在较多挑战，如新发现的蛋白翻译后修饰的富集鉴定方法，翻译后修饰的定量分析以及翻译后修饰的生物学功能等问题都是该领域目前遇到的且亟待解决的难题。

为了解新发现的蛋白质翻译后修饰在全细胞水平的修饰状态，往往需要借助高通量蛋白质组学手段实现其大规模鉴定，而这其中最重要的关键技术就是富集策略，目前大多采用的富集策略是用相应的泛抗体进行富集。对于不同类型的翻译后修饰，如何选择合适的富集方法以及对应的富集策略，将直接影响修饰蛋白及其位点的鉴定。

在生物体内，蛋白质的修饰种类不仅繁多，还具有可逆性以及时空特异性等特点，使蛋白质的修饰成为一个动态变化的过程，因此，对不同生长、分化以及代谢状态下细胞内蛋白质修饰水平的定量具有重要的意义。目前，已有的定量蛋白质组学技术手段主要分为两类，一类是稳定同位素标记方法，另一类是非标记定量方法。稳定同位素标记技术是蛋白质组学相对定量的经典方法，样品在稳定同位素标记后、质谱分析前混合，一次分析实现差异定量，有效消除了色谱和质谱分析过程中的不稳定性，最大程度减小了定量误差。常见的标记方法分为体内标记方法，如SILAC与15N标记。Mann等［87］采用同位素标记的甲硫氨酸标记细胞中的甲基基团，首次实现了甲基化翻译后修饰蛋白质组学规模上的定量分析； SILAC技术同样可以用于磷酸化与乙酰化修饰蛋白组学的规模化定量分析［29，88，89］； 由于SILAC标记方法只适用于不能自我合成氨基酸的哺乳动物细胞株，所以对于大多数原核生物并不适用，而15N标记则不受此限制［90，91］，并在蓝藻中得到了很好的应用［92—94］，因此该标记技术用于蓝藻翻译后修饰定量具有广阔的前景。而体外标记方法，如二甲基标记［95］、TMT标记［96］以及iTRAQ标记［97］等，几乎全部标记赖氨酸的活性氨基，对于许多赖氨酸上的翻译后修饰，体外标记却并不适用。另一类重要的定量技术——非标记定量蛋白质组学技术，则不需要任何昂贵的标记试剂与复杂繁琐的样品处理过程，所以适合所有类型细胞的翻译后修饰定量，如基于蛋白变性胶的非标记定量磷酸化蛋白组与非标记定量乙酰化蛋白组等［50，98］以及基于超高通量质谱的SWATH非标记定量方法［99］。但是，非标记定量蛋白质组学技术仍然不够成熟，一方面是对nano-LC-MS/MS有很大的依赖性，需要实验具有较高的重现性； 另一方面不论是常规的基于一级质谱的定量方法，还是最新建立的基于二级质谱的SWATH定量方法，对于后续数据处理过程中肽段定量的算法仍有待于进一步提高，才能更准确的定量肽段以及蛋白。从长远来看，相比于标记定量技术，非标记定量方法仍具有更大的优势和前景，而对于蓝藻的翻译后修饰定量组学，非标记定量方法则更为适用。

图3　蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002光合作用系统中的蛋白质翻译后修饰［86］Fig. 3　Post-translational modification events involved in the photosynthesis in Synechococcus sp. PCC 7002

蛋白质翻译后修饰往往不是孤立存在的，同一生理或病理过程的发生，需要各种修饰的蛋白质共同作用，同一个蛋白质又可以同时拥有一种以上的蛋白质修饰，彼此之间相互影响、相互协调。单纯的单一蛋白质、单一修饰的研究难以阐明代谢调控机制，只有运用组学手段对不同状态下的蛋白质修饰动态网络研究，才能更好的阐明不同翻译后修饰的功能以及修饰之间的相互调控。在蓝藻的光合作用途径中，已经发现许多蛋白具有不同类型的翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、甲基化等等（图3）；而不同翻译后修饰之间相互影响，对蛋白功能进行多重调控，在细胞的整个生命活动中具有非常重要的作用。不同翻译后修饰对蛋白乃至整个细胞的功能而言，可以是协同或是相反的作用，而这种情况发生的一个重要基础就是存在于各种蛋白质翻译后修饰之间的相互作用关系，因此，研究蛋白质翻译后修饰之间相互调控作用关系，将有助于揭示蓝藻细胞内蛋白质翻译后修饰介导的复杂的蛋白功能调控网络。

基于高通量蛋白质组学的翻译后修饰鉴定数据正在快速增长，尽管这些数据证明了许多蛋白质翻译后修饰是普遍存在的现象，但并没有揭示出修饰的功能。虽然，发现并鉴定新的翻译后修饰对理解生物众多生理功能具有十分重要的意义，但深入理解修饰在整个细胞中的调控作用机制则更能深入阐明翻译后修饰的重要性。目前大多数基于高通量蛋白质组学鉴定翻译后修饰的研究，也都结合分子生物学或生物化学等技术手段，挑选若干重要的翻译后修饰蛋白，试图去解释翻译后修饰的调控作用。但相比于庞大的高通量数据，仍然只有很少翻译后修饰位点的生物学功能被阐明，对于更多的修饰位点的功能，则只能通过推测讨论或生物信息学分析获得［100］。因此，细胞内各种代谢通路中的翻译后修饰作用具有怎么样的调控功能，均有待于进一步研究。

到目前为止，还没有完整的实验证据揭示蛋白质翻译后修饰在蓝藻细胞内具有怎样的调控功能。但可以预期的是，随着蓝藻细胞内越来越多的蛋白质翻译后修饰被大规模发现，这些修饰在细胞的整个生命活动中的生物学功能也将被逐渐阐明，并将开辟出蓝藻的蛋白质翻译后修饰组学这一新的研究领域。

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PROGRESS ON PROTEIN POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION IN CYANOBACTERIA

YANG Ming-Kun1，LIN Xiao-Huang1，2，MA Yan-Yan1，2，WANG Yan1，2and GE Feng1
（1. Key Laboratory of Algal Biology，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Post-translational modifications（PTMs） are vital cellular control mechanisms modulating diverse protein properties. Proteomic analysis of post-translational modifications based on the mass spectrometry has been the key research area. Recently，it has been shown that protein post-translational modifications，such as phosphorylation，acetylation，methylation，glycosylation and oxidation，play crucial regulatory role in various pathways of cyanobacteria. In the present article，we reviewed the recent progress on the functional studies of PTMs in cyanobacteria.

Cyanobacteria； Proteomics； Post translational modifications（PTMs）

Q344+.3

A

1000-3207（2016）05-1056-12

10.7541/2016.137

2015-08-28；

2016-01-11

国家自然科学基金（31570829）资助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31570829）］

杨明坤（1985—），男，湖北襄阳人； 硕士； 主要从事蛋白质翻译后修饰组学及其功能研究。E-mail：yangmingkun@ihb.ac.cn

葛峰（1971—），男，研究员； 研究方向为功能蛋白质组学。E-mail：gefeng@ihb.ac.cn