薄层色谱法对宫衣净酊成分的定性鉴别

朱永刚，王 磊，王旭荣，崔东安，张景艳，张 凯，张 康，李建喜，杨志强

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)



薄层色谱法对宫衣净酊成分的定性鉴别

朱永刚，王 磊，王旭荣，崔东安，张景艳，张 凯，张 康，李建喜，杨志强*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)

[目的]建立治疗奶牛胎衣不下的中兽药宫衣净酊的质量标准。[方法]采用薄层色谱(TLC)法对该酊剂中的中药材进行定性鉴别，确定该酊剂中葛根、红花、急性子和川牛膝的薄层鉴别方法。[结果]在选定的色谱条件下，色谱斑点分离较好，该鉴别方法能够有效鉴别葛根、红花和急性子。[结论]该试验中所建立的TLC方法简单、易操作、专一性强、重复性好，可为宫衣酊剂的质量控制提供依据。

宫衣净酊；薄层色谱法；质量标准

近年来，随着畜禽养殖的规模化和集约化发展，抗菌药物被广泛应用于畜牧生产中，由于抗生素的不合理使用，由此带来的细菌耐药性、动物卫生安全问题及畜禽产品质量安全引起了全社会的广泛关注[1-2]。中兽药由于其独特的药理学作用，且具有低毒、低残留和不产生耐药性等优点，在抗菌抗病毒的同时，还能促进动物生长，提高机体免疫力，在动物疾病的预防、治疗和保健领域得到了广泛应用[3-4]。宫衣净酊是由葛根、急性子、红花、川牛膝等中药组成，是采用中兽医群体辩证的观点，通过药材加减并经过临床的疗效试验后研制而成、采用渗漉的方法制备而成的酊剂，其临床功效主要包括活血化瘀、促进胎衣排出、净化子宫、加快产后子宫复旧、促进产后繁殖性能的恢复[5]。谢家声等[6]研究表明宫衣净酊具有治疗奶牛胎衣不下的效果，治愈率为85.7%。薄层色谱法(TLC)是一种最简单的色谱分离技术，因其具有操作简单、分离效率高、设备简单、专属性强、分析快速等特点，被广泛应用于药物分析中，特别是复方制剂的质量标准的鉴定，因此对该复方酊剂进行薄层鉴别可以为其提供质量控制依据[7-9]。为了有效控制宫衣净酊中葛根、急性子和红花的质量，保证其临床中的疗效，笔者采用薄层色谱法对宫衣净酊中葛根、急性子、红花和川牛膝进行定性鉴别。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。赛多利斯分析天平(ALC110.4)；电子调温电热套(天津市泰斯特仪器公司)；超声波清洗仪(型号KQ250，为上海昆山超声波仪器公司产品)；旋转蒸发仪(EYELA，为上海爱朗仪器公司产品)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A)；全自动薄层色谱点样仪(型号SP-20E，为上海科哲生化科技有限公司产品)。

1.1.2药品与试剂。宫衣净酊样品，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽医研究室研制，200 mL/瓶；葛根药材、红花药材、急性子药材、川牛膝药材，均购自兰州黄河药材市场；葛根素标准品(批号110752-201313，由中国食品药品鉴定研究院提供)；急性子对照药材(批号121628-201001，由中国食品药品鉴定研究院提供)；红花对照药材(批号120907-201111，由中国食品药品鉴定研究院提供)；杯苋甾酮标准品(批号111804-201303)。硅胶G板和H板(10 cm×20 cm)，均购自青岛海洋化工有限公司；其余试剂均为分析纯；超纯水。

1.2方法

1.2.1急性子的薄层鉴别。 取宫衣净酊溶液 10 mL，蒸干，用 5 mL 纯化水充分溶解，用 10 mL 石油醚(60～90 ℃)萃取1次，弃去石油醚层，水层分别用20、20、10 mL水饱和正丁醇萃取 3 次，合并正丁醇层液体，蒸干，用 2 mL 80%丙酮溶解，作为供试样品溶液。按照处方称取除急性子以外的药材，配制阴性对照溶液。称取急性子对照药材 4.0 g，加热回流 1 h，弃去丙酮液，药渣挥干，加入水饱和正丁醇 40 mL，超声处理 30 min，过滤，将滤液蒸干，在残渣中加入甲醇 2 mL使其溶解，作为对照药材溶液。吸取上述3种溶液各 2 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10.0∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，应在与对照药材色谱相应的位置上显示相同颜色的荧光斑点[6]。

1.2.2红花的薄层鉴别。 取宫衣净酊溶液 10 mL，蒸干，用 5 mL 纯化水充分溶解，用 10 mL 石油醚(60～90 ℃)萃取1次，弃去石油醚层，水层分别用20、20、10 mL水饱和正丁醇萃取 3 次，合并正丁醇层液体，蒸干，用 2 mL 80%丙酮溶解，作为供试样品溶液。按照处方称取除红花外的药材，配制阴性对照溶液。称取红花药材粉末 0.5 g，加入80%丙酮溶液 5 mL，密塞，振摇 15 min，静置，取上清液作为供试品溶液。另外称取红花对照药材 0.5 g，按照相同方法制成对照药材溶液。吸取上述样品2 μL，分别点于同一硅胶 H 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，应在于对照药材色谱相应的位置上显示相同颜色的荧光斑点。

1.2.3葛根的薄层鉴别。 取宫衣净酊溶液 10 mL，蒸至无醇味，加入纯化水稀释，用 20 mL 三氯甲烷萃取，弃去三氯甲烷层，水层液体用20、20、10 mL水饱和正丁醇萃取 3 次，取正丁醇液蒸干，用纯甲醇溶解至 2 mL，作为供试品溶液。按照处方取除葛根外的所有药材，配制阴性对照溶液。称取葛根对照药材粉末 0.8 g，加入甲醇 10 mL，放置 2 h，过滤，滤液蒸干，在残渣中加入甲醇 1 mL 使其溶解，作为对照药材溶液。取葛根素对照品，加入甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3种溶液各 2 μL，其他样品溶液各 1 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，应在与对照药材色谱相应的位置上显示相同颜色的荧光斑点。

1.2.4川牛膝的薄层鉴定。取“宫衣净酊”样品溶液 20 mL，浓缩至约 2 mL，添加于中性氧化铝柱(100～200 目，2.0 g，内径 15 mm)上，用甲醇-乙酸乙酯(1∶1)40 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，在残渣中加入甲醇 2 mL使其溶解，作为供试品。按照处方称取除葛根外的药材，配制阴性对照溶液。另取川牛膝对照药材 2 g，按照相同方法制成对照药材溶液。再取杯苋甾酮对照品，加入甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液各 2 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷上 10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加热至斑点显色清晰，置于紫外灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，应在与对照药材色谱相应的位置上显示相同颜色的荧光斑点。

2　结果与分析

2.1急性子的薄层鉴别从图1可以看出，3批供试品宫衣净酊色谱中，在与急性子对照药材色谱的相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，缺急性子的阴性对照在相同位置上无相应的斑点，说明阴性对照无干扰，薄层色谱法对急性子的鉴定具有专一性。

注：1.宫衣净酊阴性样品；2～4.宫衣净酊样品；5.急性子对照药材。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Control of garden balsam seed.图1　宫衣净酊中急性子的TLC图谱Fig.1　TLC of garden balsam seed in Gongyijing tincture

2.2红花的薄层鉴别 从图2可以看出，3批供试品宫衣净酊色谱中，在与红花药材和红花对照药材色谱的相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，缺红花的阴性对照在相同位置上无相应斑点，说明阴性对照无干扰，薄层色谱法对红花的鉴定具有专一性。

注：1.宫衣净酊阴性样品;2～4.宫衣净酊样品;5.红花药材;6.红花对照药材。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Safflower；6.Control of safflower.图2　宫衣净酊中红花的TLC图谱Fig.2　TLC of safflower in Gongyijing tincture

2.3葛根的薄层鉴别从图3可以看出，3批供试品宫衣净酊色谱中，在与葛根素标准品和葛根对照药材色谱的相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，缺葛根的阴性对照在相同位置上无相应的斑点，说明阴性对照无干扰，薄层色谱法对葛根的鉴定具有专一性。

注：1.宫衣净酊阴性样品;2～4.宫衣净酊样品;5.葛根对照药材;6.葛根素标准品。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Control of puerarin；6.Standard substance of puerarin.图3　宫衣净酊中葛根的TLC图谱Fig.3　TLC of puerarin in Gongyijing tincture

2.4川牛膝的薄层鉴别从图4可以看出，3批供试品宫衣净酊色谱中，在与杯苋甾酮标准品和川牛膝对照药材色谱的相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，缺川牛膝的阴性对照在相同位置上无相应的斑点，说明阴性对照无干扰，薄层色谱法对川牛膝的鉴定具有专一性。

注：1.宫衣净酊阴性样品;2～4.宫衣净酊样品;5.川牛膝对照药材;6.杯苋甾酮标准品。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture； 2-4.Gongyijing tincture sample； 5.Control of Radix Cyathulae； 6.Standard substance of Radix Cyathulae.图4　宫衣净酊中川牛膝的TLC图谱Fig.4　TLC of Radix Cyathulae in Gongyijing tincture

3　讨论与结论

酊剂是药物用规定浓度乙醇提取或溶解制成的澄明液体制剂，也可用流浸膏稀释制成。一般药材制成浓度20 g/mL，含剧毒药物10 g/mL。酊剂具有杂质含量少、药量高、服用剂量少、制备简单、易保存、不易变质的特点[10]。宫衣净酊以补气益血、行滞祛瘀、利水消肿的红花、葛根、急性子、川牛膝为主药。该组方中红花具有活血通经、祛瘀止痛、抗菌消炎、解热镇痛等功效，且对子宫具有兴奋作用，小剂量使用可使子宫发生节律性收缩，大剂量使用则使其收缩加强[11]；红花对妊娠动物的作用尤为明显[12]。葛根具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻等功效，且具有抗氧化损伤、抗细胞凋亡的作用[13]。急性子具有消积、破血、软尖、抗菌、抗氧化等功效[10]，且具有兴奋子宫平滑肌、加强子宫收缩的作用[14]。川牛膝具有活血祛瘀、利尿通淋、引血下行等功效[15]。通过结合以上4种中药材的药理特性、配伍关系及酊剂的特点，该中药酊剂可用于治疗奶牛胎衣不下，且临床效果显著。

笔者参照《中国兽药典》中对红花、葛根、急性子、川牛膝4味药材的鉴别方法，通过对照品、供试品、阴性样品色谱的比较试验，确定了宫衣净酊中4味药材的薄层鉴别方法。这4种方法专属性强，制备简单，检测快速，样品与对照品相应的位置上显示相同的斑点，阴性对照无干扰，可作为宫衣净酊中急性子、红花、葛根和川牛膝的定性鉴别方法。在葛根的鉴别中，《中国兽药典》2010年版(2部)葛根的薄层鉴定方法，结果发现斑点分离不明显；结合《中国药典》2010年版(1部)中当归拈痛丸中的处理方法，结果显示斑点清晰，说明薄层色谱方法对葛根的鉴定具有专一性。在红花的鉴别中，参照《中国兽药典》2010年版(1部)红花的薄层鉴定方法，结果发现相应的点分离较差，且其他成分干扰较严重；结合《中国药典》2010年版(1部)中化积口服液中红花的处理方法，结果显示斑点清晰，说明薄层色谱方法对红花的鉴别具有专一性。在急性子的鉴别中，参照《中国兽药典》中急性子的鉴别方法试验，效果不明显；参照红花的鉴别方法，发现能分离对应斑点，但分离不彻底，后对急性子的不同展开液进行优化，发现采用三氯甲烷-甲醇(10.0∶0.5)为展开剂比三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(10.0∶0.5)[10]为展开剂的分离效果更好。在川牛膝的鉴别中，参照《中国兽药典》2010年版(2部)川牛膝的薄层鉴定方法，结果显示斑点清晰，说明薄层色谱方法对川牛膝的鉴别具有专一性。

宫衣酊剂为活血化瘀、促进产后子宫的复旧、提高产后繁殖性能的新兽药产品，为了保证其临床疗效，应建立质量标准，以保证该酊剂的质量。该研究中采用的TLC法可以对宫衣净酊进行薄层鉴别，且方法简单，专一性较强，可以达到控制宫衣净酊质量的目的。

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Quanlitative Identification of Gongyijing Tincture Composition by Thin Layer Chromatography

ZHU Yong-gang, WANG Lei, WANG Xu-rong, YANG Zhi-qiang*et al

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS, Engineering & Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730050)

[Objective] To establish quality standards of Gongyijing tincture to cure retained fetal membranes. [Method] Thin layer chromatography (TLC) method was used for qualitative identification of the traditional Chinese medicine in Gongyijing tincture. Puerarin, safflower and garden balsam seed and Radix Cyathulae were identified by TLC in Gongyijing tincture. [Result] Under the selected chromatographic conditions, chromatographic spots were better separated. This identification method could effectively identify puerarin, safflower, and garden balsam seed. [Conclusion] The established TLC method was simple, easy to operate, has strong specificity and good repeatability, which provides

for the quality control of Gongyijing tincture.

Gongyijing tincture; Thin layer chromatography (TLC); Quality standard

公益性行业(农业)科研专项(201303040)；中国农业科学院中兽医与临床创新团队项目(CAAS-ASTIP-2015-LIHPS-06)。

朱永刚(1991- )，男，安徽安庆人，硕士研究生，研究方向：奶牛中兽药研发。*通讯作者，研究员，博士生导师，从事奶牛疾病相关研究。

2016-07-22

S 853.7

A

0517-6611(2016)27-0114-03