猪流行性腹泻病毒SD2014株全基因组序列测定与遗传演化分析

高翔，李栋梁，赵景义，徐发荣，陈艳红，周磊

（1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；2.北京市动物疫病预防控制中心，北京大兴102600）

猪流行性腹泻病毒SD2014株全基因组序列测定与遗传演化分析

高翔1，李栋梁2，赵景义2，徐发荣2，陈艳红1，周磊1

（1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；2.北京市动物疫病预防控制中心，北京大兴102600）

为分析猪流行性腹泻病毒（PEDV）在国内的流行及变异情况，对2014年在山东省某猪场流行的PEDV毒株SD2014进行全基因组测序，并与国内外代表毒株进行序列比对、同源性分析和遗传演化分析。结果表明，SD2014毒株全长28，036 nt（除去PolyA）。遗传演化分析显示该毒株与美国分离株OH851以及我国2010年后分离的变异毒株属于同一分支。通过对S基因和ORF3序列进行对比，发现SD2014与我国早期分离株BJ-2011-1变异位点相似，且与欧美毒株和疫苗株（CV777）差异明显。提示自2010年PED暴发后，与疫苗株差异较大的变异株仍在国内流行，该病防控形势依然严峻。

猪流行性腹泻病毒；全基因组序列；遗传演化

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种猪的高度接触性传染病，感染猪以急性肠炎、水样腹泻、呕吐为主要特征［1-2］。5日龄及以下仔猪由于腹泻和呕吐造成严重脱水，死亡率可高达90%～100%。该病自1971年首次在英国被发现以来［3］，在世界上多个养猪国家均已有报道［4-7］。2010年冬季以来，我国各省份均暴发了有史以来最为严重的PED，2013年5月后北美各国及日本也有大量关于PED的报道［8-13］。对大量PEDV临床分离株进行序列测定及抗原分析发现，不同的PEDV毒株在基因序列和抗原性等方面都存在较大差异，并可导致致病性的差异。因此，分析PEDV各毒株的基因变异、亲缘关系以及与疫苗株的相似性对阐明流行毒株的遗传演化规律，以及今后PEDV疫苗株的选择提供重要的理论依据。

1材料与方法

1.1待检样品采自山东省疑似PED发病仔猪的肠道组织及粪便，-80℃保存。

1.2主要试剂KOD聚合酶、M-MLV、RNA酶抑制剂、dNTPs、pEASY-Blunt克隆试剂盒，购自北京全式金公司；TRIzol，购自Invitrogen公司；胶回收纯化试剂盒，购自OMEGA公司；RACE试剂盒购自Takara公司。

1.3引物设计参考实验室前期研究，将病毒全基因组分为27个片段，运用Oligo7软件设计54条PCR引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。1.4病料处理及RNA提取取发病仔猪肠道组织、粪便等加入DMEM后研磨制成悬液，离心取上清，用TRIzol提取RNA。

1.5反转录选用下游引物，M-MLV进行RNA反转录，制备cDNA模板。反转录体系共20 μL，具体为5Xbuffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10μmol/L下游引物2 μL、M-MLV反转录酶0.5 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、RNA模板12 μL；42℃反应1 h。

1.6PCR扩增及片段回收选用片段特异性引物，配置PCR反应体系，共50 μL

2xbuffer 25 μL、2 mmol/L dNTPs 10 μL、10 μmol/L上下游引物各1.5 μL、KOD酶1 μL、cDNA模板3 μL，剩余用无菌双蒸水补足至50 μL。反应程序为94℃3 min，98℃10 s、55℃30 s、68℃30 s/kb延伸，30个循环，68℃7 min。PCR后胶回收目的片段。每个片段独立重复3次。

1.7克隆测序使用pEASY-Blunt克隆目的片段，阳性质粒送至铂尚生物测序。测序结果经DNAstar软件拼接，采用ClustalX、Lasergene、GeneDoc等进行序列比对，使用ClustalW算法将测定的序列与PEDV经典毒株和变异株进行同源性分析，并使用Neighbor-Joining Method在MGEA 5.1软件中绘制进化树，Bootstrap数为1000。

2结果与分析

2.1片段扩增经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片段与预期大小一致（图1）。

图1SD2014毒株全基因组引物扩增结果

2.2序列测定与拼接利用通用测序引物M13F/ R对阳性克隆进行测序，经3次独立实验选取保守序列。使用DNAstar把27个片段序列进行拼接，得到SD2014的全基因组序列，全长为28，036nt（不含polyA尾），已录入GenBank数据库（登录号：KX064280.1）

2.3病毒的全基因组序列分析参考国内外PEDV毒株的序列，对SD2014进行全基因组分析。基因组的组成及各段基因的位置和长度见表1。

表1SD2014的全基因组组成

通过分子生物学软件Lasergene和MEGA5.1，将SD2014与另外49株国内外PEDV毒株进行序列对比并绘制出进化树。

从图2可以看出，在进化树中PEDV毒株可以分成两个分支，一组全部为2010年暴发后的变异毒株，另一组主要为疫苗用毒株及2010年前的早期分离株。SD2014与2013年在美国暴发的毒株亲缘性较近，而且与2010年后在中国大量流行的毒株同属于同一个大分支内，而与2010年前的经典毒株及疫苗株都有较大的差别。

选取不同地域的分离株与SD2014进行核苷酸与氨基酸同源性对比，见表2。其中SD2014全基因组同源性与我国早期分离株BJ-2011-1最近，其次是美国分离株OH851以及韩国分离株KNU-1406-1，而与疫苗株CV777以及SM98亲缘性较远。

2.4S基因比对S基因与PEDV免疫保护相关，同时也是PEDV变异最大的基因，SD2014的S基因全长4 161 nt，编码1 386个氨基酸，分为S1、S2区域。SD2014与其他7株PEDV毒株相比较，核苷酸同源性为93.6%～99.0%，氨基酸的同源性为92.5%～99.1%。SD2014变异情况和BJ-2011-1最为相似，在S1区域内与其他毒株存在明显差异，如图3所示。

2.5ORF3比对ORF3为PEDV的非结构蛋白编码基因，可影响病毒致病性。SD2014中ORF3全长为675 nt，编码224个氨基酸。将8株PEDV毒株的ORF3进行序列对比，可知SM98与SD2014和其他毒株相比在C端有70个氨基酸的缺失，其余序列整体上变异不大。SD2014在以下几个氨基酸位点出现突变（93：L-＞F，147-148：LE-＞AL；159：S-＞F）。

图2全基因组遗传进化树

3讨论

PED作为养猪业危害较严重的传染病之一，自2010年全国性暴发之后近年仍在各省份散在发生。SD2014引起发病的猪场，PED发病率为80%，死亡率约为30%。

通过对SD2014及49株PEDV毒株进行全基因组序列比对并绘制进化树发现毒株可总体分成两大分支，一支是以CV777、SM98为代表的经典毒株群，包括国内最早的分离株CH/S，及少量2010年后分离的毒株，另一支则全部为2010年暴发后的分离株，以SD2014，BJ-2011-1和国外毒株OH851为代表。SD2014与2010年后分离毒株亲缘性较近，与疫苗株亲缘关系较远，核酸同源性只有96.5%～96.7%，并且变异集中发生在S基因和ORF3区域。

S蛋白具有促进宿主免疫应答、介导病毒入细胞等功能，同时其编码区域为PEDV变异最大的区域之一。S基因序列比对发现，SD2014与CV777和SM98 S基因的同源性只有93.6%～93.9%，同2010年后的分离毒株相似，较经典毒株在此区域存在插入和缺失等变异情况，这可能是导致毒株毒力变强以及免疫失效的一个原因。

表2SD2014与7株国内外PEDV毒株全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性比较

综合以上结果表明，2010年后暴发的一批变异毒株目前仍在我国流行，并以成为我国田间主要流行株。该类毒株与疫苗株亲缘性较远，是造成免疫失效的重要原因，其为PED的预防和控制的提出了新的挑战。

图3SD2014毒株与参考毒株S基因编码氨基酸序列对比

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WholeGenomic Sequencing and Phylogenic Analysis of PorcineEpidemic Diarrhea Virus SD2014 Strain

GAO Xiang1，LI Dong-liang2，ZHAO Jing-yi2，XU Fa-rong2，CHEN Yan-hong1，ZHOU Lei1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing Center for Animal Disease Control and Prevention，Beijing 102600，China）

To analyze the variation and epidemic situation of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）in China，the whole genomic sequencing，sequence aligning and phylogenetic analysis on the newly isolated strain SD2014 were performed.The results showed that the whole genome of SD2014 virus was 28，036 nt in length，excluding PloyA tail.A according to the phylogenetic analysis，SD2014 was clustered with American prototype strain OH851 and Chinese variants isolated after 2010，in the same branch.Based on the results of sequence alignment on S gene and ORF3，the SD2014 shared high identities with representative strain BJ-2011-1 of chinese isolates but low identity with vaccine strain CV777，suggesting that the variant is still circulating in the field，and causes problems for PED prevention and control.

porcine epidemic diarrhea virus；whole genomic sequence；evolution

s：CHEN Yan-hong；ZHOU Lei

S852.65+1

A

0529-6005（2016）08-0012-04

2016-07-07

高翔（1995-），男，本科生，专业方向为动物病毒遗传演化分析和诊断方法的URP研究，E-mail：stu2088@163.com

陈艳红，E-mail：chenyh@cau.edu.cn；周磊，E-mail：leosj@cau.edu.cn