降压类中成药及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量检测方法研究

马春艳，封淑华，冯丽，段琼，胡伟杰

（河北省药品检验研究院，河北石家庄050011）

降压类中成药及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量检测方法研究

马春艳，封淑华，冯丽，段琼，胡伟杰

（河北省药品检验研究院，河北石家庄050011）

目的建立降压类中成药及保健食品中非法添加氯沙坦的定性及定量检测方法。方法采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF）联用技术对降压类中成药及保健食品中非法添加的氯沙坦进行定性筛查，采用Shimadzu Shim-pack XRODS色谱柱（100 mm×2.0 mm，2.2 m），以0.5%甲酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，电喷雾离子源（ESI），正负离子检测，扫描范围m/z 100～1 000。经筛查为阳性的样品用超高效液相色谱进行紫外吸收光谱定性鉴别和定量测定，采用Waters XBridgeTM色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 m），以0.2%磷酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，检测波长为220 nm，流速为1.0 mL/min。结果通过对9批降压类中成药和保健食品进行快速质谱定性筛查，有2批样品检出氯沙坦，含量分别为48.3，20.9 mg/g。结论该方法准确性好、灵敏度高、选择性强，可作为降压类中成药及保健食品中非法添加氯沙坦的检验方法。

中成药；保健食品；非法添加；氯沙坦；超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱联用

随着我国高血压患者人数的不断增加，降压药物需求量也不断增大。一些不法分子为追求经济利益，在降压类中成药及保健食品中非法添加化学药物，对服用患者的安全造成严重隐患，甚至危及生命［1］。目前，国家食品药品监督管理总局在降压类药物非法添加检验方法中收载了阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、硝苯地平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平12种药物［2-3］，但一些不法分子为了规避处罚，在降压类中成药和保健食品中添加这些补充检验方法之外的其他化学药物。本试验中基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLCQ-TOF）联用技术，查阅相关文献［4-16］，广泛收集临床使用的和作为副作用具有降压效果的药物，建立降压类药物质谱数据库。通过质谱数据库的快速筛查，检测到降压类中成药及保健食品中添加了化学药物氯沙坦。氯沙坦是一种口服高度特异性的非多肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，可以阻滞内源性及外源性的血管紧张素Ⅱ所产生的各种药理作用，包括促使血管收缩、醛固酮释放等作用，为新型抗高血压药物［17］，不仅具有安全、平稳的降压作用，还能改善心肾功能［18］。但长期或超剂量服用会对身体造成严重伤害。为准确测定阳性样品中氯沙坦的含量，本研究中建立了降压类中成药及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量检测方法。扩大了国家食品药品监督管理总局（CFDA）补充检验方法的检测范围。

1　仪器与试药

1.1仪器

TripleTOF®5600+液质联用仪（美国AB Sciex公司）；Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；戴安U3000型高效液相色谱仪（美国Thermofisher公司）；Milli-Q型超纯水器（美国Millipore公司）；KH-800 KDE型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2试药

乙腈、甲酸均为色谱纯（Fisher公司），水为自制超纯水，甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司）及其余试剂均为分析纯；氯沙坦钾对照品（European Pharmacopeia Reference Standard，批号为006MW7）；样品为市场监督抽验降压类中成药及保健食品。

2　方法与结果

2.1检测条件

2.1.1UPLC-Q-TOF色谱条件

色谱柱：ShimadzuShim-packXR-ODS柱（100mm× 2.0 mm，2.2 μm）；流动相：0.5%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，8%B；5～18 min，8%～65%B；18～22 min，65%B）；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样量：5 μL。

2.1.2UPLC-Q-TOF质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正负离子扫描，采用信息触发采集模式（IDA），GS1（55 psi），GS2（55 psi），CUR GAS（30psi），离子源温度（550℃），电喷雾电压（ESI+：5500V，ESI-：-4 500 V），其他质谱参数见表1。

表1　质谱仪参数设置表

2.1.3UPLC定量条件

色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5min，10%B；5～25 min，10%～70%B；25～30min，70%B）；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；二极管阵列检测器，波长扫描范围：190～400 nm；检测波长：220 nm；进样量：5 μL。

2.2溶液制备

对照品溶液：精密称取氯沙坦钾对照品适量，加甲醇振摇使溶解，制成对照品贮备液（质量浓度为1.25 g/L）。精密量取对照品贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（质量浓度为0.25 g/L）。

供试品溶液：取供试品1次服用量（若供试品为固体，则研成细粉，精密称定；若供试品为液体，则精密量取），置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声15 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm有机滤膜，取续滤液，即得。视样品浓度情况，适当对样品进行浓缩或稀释。

空白溶液：取空白样品适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备空白溶液。

2.3氯沙坦定性鉴别

2.3.1质谱信息

精密吸取氯沙坦钾对照品溶液，加甲醇稀释成质量浓度为2 μg/mL的对照品溶液，注入液质联用仪，按2.1.1和2.1.2项下条件，分别进行正负离子一级、二级全扫描。详细质谱信息见表2。

表2　氯沙坦质谱信息

2.3.2紫外吸收光谱信息

按2.1.3项下条件，对氯沙坦钾对照品溶液在190～400 nm波长范围内进行扫描，其最大吸收波长为203 nm。为避免末端吸收的干扰，最终确定检测波长为220 nm。

2.4定量检测方法学考察

专属性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各5 μL注入液相色谱仪，测定。结果氯沙坦与其他杂质峰分离良好，空白溶液在氯沙坦相应保留时间处无干扰。

线性关系考察：精密量取2.2项下对照品贮备溶液，分别稀释成0.005，0.025，0.050，0.250，0.500，1.000，1.250 g/L的梯度对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积。以质量浓度（X，g/L）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=210.77 X+0.643，r=0.999 9（n=7）。结果表明，氯沙坦钾质量浓度在0.005～1.250 g/L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度与重复性试验：精密吸取氯沙坦钾对照品溶液，重复进样6次，测定，结果的RSD为0.4%（n=6），表明仪器精密度良好。取阳性样品，一式6份，依法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定并计算含量，结果的RSD为0.9%（n=6），表明方法的重复性良好。

定量限及检出限确定：精密称取氯沙坦钾对照品溶液，逐级稀释后进样测定。当信噪比（S/N）为3时，检出限质量浓度为50 ng/L；S/N为10时，定量限质量浓度为150 ng/L。

稳定性试验：取对照品溶液和供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12，24 h时进样测定。结果峰面积的RSD分别为0.6%和0.3%（n=7），表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定。

回收率试验：精密称取空白样品共9份，精密加入不同量对照品（低、中、高质量浓度各3份），按2.2项下方法处理加标样品，得回收率样品溶液，进样测定，按外标法计算回收率。结果平均回收率为99.1%，RSD为1.9%（n=9），表明方法准确性良好。

耐用性试验：取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液分别在3根不同品牌、不同规格的色谱柱中进行测定。色谱柱规格型号见表3。结果氯沙坦与其他峰分离良好，保留时间适中，空白溶液在氯沙坦位置无干扰，见图1。

表3　色谱柱规格型号

图1　耐用性试验色谱图

2.5样品测定

2.5.1供试品质谱定性鉴别

按2.1.2项下质谱条件，取对照品溶液和供试品溶液各5 μL注入质谱仪，对风险监测、日常监督抽验中具有辅助降血压功能的9批样品进行非法添加氯沙坦钾的测定。结果有2批供试品溶液中显示与氯沙坦对照品一致的一级和二级质谱图，见图2。

2.5.2供试品色谱定性鉴别

将质谱初筛呈阳性的2批供试品用2.1.3项下条件进行定性鉴别。结果显示，供试品溶液具有与氯沙坦钾对照品溶液保留时间一致的色谱峰和紫外吸收光谱，见图3。

图2　氯沙坦对照品和供试品质谱图

2.5.3供试品液相色谱含量测定

将定性筛选出的2批供试品按2.1.3项下条件进行定量测定，按外标法计算峰面积，测得样品含量为48.3，20.9 mg/g（以氯沙坦钾计）。按样品的服用量计算，与氯沙坦钾片日口服剂量（25～100 mg）相当。

3　讨论

本研究中采用建立的降压类药物质谱数据库，通过化学式和精确分子量快速筛查发现国家补充检验方法中未收载的降压化学药物氯沙坦。为了进一步验证，通过购买对照品，与对照品进行保留时间、紫外吸收光谱、一级及二级质谱的比对，从而建立降压类中成药和保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量方法，增加了国家非标准检验的品种，扩大了国家补充检验方法的检测范围，为降压类中成药和保健食品中非法添加化学药物的定性定量检测提供了有力的技术支撑。

图3　氯沙坦对照品和供试品的液相色谱图及紫外吸收光谱图

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Qualitative and Quantitative Method Study of Losartan Illegally Added into Antihypertensive Traditional Chinese Medicine and Health Food

Ma Chunyan，Feng Shuhua，Feng Li，Duan Qiong，Hu Weijie
（Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang，Hebei，China050011）

ObjectiveTo establish a qualitative and quantitative method for the detection of losartan illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines and health food.MethodsQualitative screening of losartan illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicine and health food was firstly performed by UPLC-Q-TOF-MS/MS.The qualitative analysis was performed on a Shimadzu Shim-pack XR-ODS column（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）with the mobile phase of acetonitrile and 0.5%formic acid by gradient elution，the flow rate was 0.3 mL/min.Electrospray ionization source（ESI）was operated in positive and negative mode.The scan range was from 100 to 1 000 m/z.The quantitative detection of positive sample detected by UPLC-Q-TOF-MS/MS was used by HPLC，Chromatographic separation was achieved on a Waters XBridgeTMC18column（150 mm×4.6 mm，5 μm）with the mobile phase of acetonitril and 0.2%phosphate by gradient elution.The detection wavelengths was 220 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. ResultsSampling from the market in 9 batches of Chinese patent medicines and health food diet，there were 2 batch samples detected illegally added losartan.The losartan content was 48.3，20.9 mg/g.ConclusionThe method is rapid，accurate and highly sensitive，which can be used as a supplementary test method of antihypertensive traditional Chinese medicines and health food illegally added losartan.

Chinese patent medicine；health food；illegal added；losartan；UPLC-Q-TOF-MS/MS

R927.1；R972+.4

A

1006-4931（2016）12-0064-05

河北省食品药品监督管理局科技重点项目，项目编号：ZD2014006。

马春艳（1984-），女，硕士研究生，主管药师，主要从事保健食品和药物分析工作，（电子信箱）nancyma054@163.com；封淑华（1964-），女，主任药师，研究方向为药物分析，本文通讯作者，（电话）0311-89892090（电子信箱）shuhua08@sina.com。

（2015-10-14；

2016-02-02）