空气凤梨叶片蜡质成分及叶表结构研究

郑桂灵 张 伟 李 鹏

(青岛农业大学资源与环境学院，青岛 266109)

空气凤梨叶片蜡质成分及叶表结构研究

郑桂灵 张 伟 李 鹏*

(青岛农业大学资源与环境学院，青岛 266109)

空气凤梨是一类依靠叶片吸收水分和养分的特殊植物类群。为进一步探讨其叶片功能，以五种空气凤梨为材料，通过扫描电镜(SEM)和气相色谱—质谱联用法(GC-MS)分析了其叶表结构和蜡质成分。结果表明空气凤梨叶表面覆盖有白色、蜡质、葵花状的鳞片，由翼状细胞、环状细胞和碟状细胞三种细胞构成。叶片蜡质成分中以低极性的烃、醇、酮、酯等物质为主，可起到有效减少水分散失的作用。对五种空气凤梨叶片蜡质成分总含量分析表明，小精灵空气凤梨﹥贝克利空气凤梨﹥维路提拉空气凤梨﹥女王头空气凤梨﹥电卷烫空气凤梨。而相关性分析则表明，蜡质成分总含量与空气凤梨鳞片总面积呈显著的正相关，暗示空气凤梨叶片蜡质成分主要存在于叶表的鳞片上。

空气植物；叶表鳞片；气相色谱-质谱联用；蜡质成分

叶片是植物体与外界环境接触的主要部位，其表面结构与化学成分对叶片功能的行使，如光合作用、呼吸作用等都有着重要影响。蜡质成分是植物叶片中最常见的一类化学成分，常覆盖在植物叶片表皮之上，既是植物与外界环境接触的界面，也是植物进行自我防护的一道屏障[1～2]。不同植物的蜡质成分复杂，可由醇、萜类、酮等组成，蜡质含量也因植物的不同而有较大差异[3～4]。

空气凤梨隶属于凤梨科(Bromeliaceae)，主要存在于铁兰属(Tillandsia)中，是一类生长在空气中、不需要土壤就可以生存的特殊植物类群，常被称为“空气植物”，具有重要的观赏与应用价值。虽原产南美，但现已在全世界引种栽培。它们生长所需的水分和营养可以全部来自空气，而暴露于空气中的最主要的部分—叶片，一直被认为是空气凤梨直接从空气中吸收水分和养分的主要器官[5]。鳞片则是空气凤梨叶表面最明显、也最特殊的结构，白色、蜡质，密布叶片表面[5～6]。

但是，迄今为止，对凤梨科植物的栽培技术、污染物吸收、光合作用等方面已有较多的研究[7～9]，却从未对覆盖蜡质鳞片的空气凤梨叶片化学成分进行研究。因此，本文在通过扫描电镜分析叶片表面结构的基础上，采用气相色谱—质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术对5种空气凤梨叶片所含的化学成分进行了分析，并将二者结合起来探讨叶片蜡质成分的主要存在部位，为进一步揭示这一特殊植物类群的叶片功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

所用五种空气凤梨分别为电卷烫空气凤梨(T.streptophylla)、维路提拉空气凤梨(T.velutina)、女王头空气凤梨(T.medusa)、贝可利空气凤梨(T.brachycaulos)及小精灵空气凤梨(T.ionantha)。因空气凤梨植物品种繁多，命名复杂，为方便区分，此处皆取其品种名。

1.2 叶表结构分析

取空气凤梨成熟植株的相同部位叶片，清洁后用4%的戊二醛固定48 h，蒸馏水洗涤，分别用30%、50%、70%、80%、90%、100%(2次)梯度浓度的酒精脱水各10 min。脱水后立即将样品固定在载破片上，置密闭容器内自然晾干。离子溅射仪镀膜，Leica S440型扫描电子显微镜观察，拍照。

1.3 叶片蜡质成分提取

用超纯水将空气凤梨叶片表面清洗干净，晾干。然后将叶片浸没于30 mL氯仿5 min后取出(此过程要轻轻摇晃)。之后加入10 μL C24烷烃(10 μg·μL-1)作为内参，用滤纸对粗提蜡质进行过滤，室温下自然挥发浓缩至0.5～1.0 mL。将蜡质转入气相色谱样品瓶中，用氮气吹干氯仿。加入40 μL吡啶溶解蜡质，再加入40 μL BSTFA(N，O—双三甲基硅烷基三氟乙酰胺)硅烷化试剂，起到保护羟基的作用。密封，70℃反应50 min。衍生反应结束后用氮气吹干衍生试剂，加入1.5 mL氯仿溶解，供气相色谱—质谱联用(GC-MS)分析。

1.4 叶片蜡质成分分析

用美国Agilent公司气相色谱质谱联用仪(5975B/6890N)进行分析。分析条件如下：载气为氦气，流量为1.2 mL·min-1，进样口温度310℃，不分流进样。色谱柱：HP-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm，升温程序：初始温度为50℃，保持3 min，以5℃·min-1升至280℃，保持10 min。质谱条件：传输温度为280℃，扫描质量范围为40～50 000，离子源温度240℃，四级杆温度150℃。各化合物依据其沸点不同得到分离，经过GC-MS检测，使用联机分析软件，通过MS得到其离子峰，依据质谱库对离子进行鉴定。采用软件对各化合物峰面积进行积分，以C24烷烃为内标物，利用内标法定量分析各蜡质成分含量。

1.5 叶片蜡质成分与鳞片之间关系分析

利用Micrometrics SE Premium图像处理软件对获得的显微结构图像进行分析。5种凤梨各选取10个视野，在超微图像上测量鳞片的面积。以SPSS18.0对单位叶面积上蜡质成分含量与鳞片总面积进行相关性分析，探讨叶片蜡质成分与鳞片之间的关系。

2 结果

2.1 空气凤梨叶表结构分析

5种凤梨植物叶表面可见表皮细胞、气孔和鳞片3种结构(图1)。但除电卷烫空气凤梨(图1:A)叶表可见表皮细胞和气孔外，其他4种空凤由于鳞片密集，覆盖在植物叶表面，表皮细胞与气孔几乎不可见(图1:B～E)。

空气凤梨叶表面最明显的结构鳞片均呈白色、蜡质，形状类似“葵花”状(图1)。每一鳞片都由三层细胞构成，最外层是长长的翼状细胞(Wing cell)，翼状细胞相互之间连接紧密，边缘有锯齿，但每一种空凤的翼状细胞形状均有所不同；最中央一层呈碟状，称之为碟状细胞(Disc cell)；在内外两层细胞之间环绕着一层细胞，称之为环状细胞(Ring cell)。

图1 五种空气凤梨的叶表面结构 A.电卷烫空凤；B.维路提拉空凤；C.女王头空凤；D.贝可利空凤；E.小精灵空凤Fig.1 Leaf surface structures of five Tillandsia species A.T.streptophylla; B.T.velutina; C.T.medusa; D.T.brachycaulos; E.T.ionantha

成分Components(n=3)烃类Hydrocarbons醇类Alcohols酮类Ketones酯类Esters酸类Acids贝可利空凤T．brachycaulos绝对含量Absolutecontent(μg·cm-2)1．07±0．081．02±0．060．24±0．020．61±0．030．08±0．01相对含量Relativecontent(%)35．46±2．3833．77±2．057．93±0．7620．16±1．882．68±0．43维路提拉空凤T．velutina绝对含量Absolutecontent(μg·cm-2)0．73±0．060．17±0．020．15±0．020．68±0．06相对含量Relativecontent(%)41．98±3．249．96±1．188．92±0．9739．14±2．65女王头空凤T．medusa绝对含量Absolutecontent(μg·cm-2)0．73±0．080．09±0．010．10±0．010．66±0．07相对含量Relativecontent(%)46．10±3．845．91±1．036．48±1．241．51±3．38—电卷烫空凤T．streptophylla绝对含量Absolutecontent(μg·cm-2)0．30±0．050．11±0．020．05±0．010．13±0．03相对含量Relativecontent(%)51．61±4．1718．34±2．128．15±0．8821．90±1．87—小精灵空凤T．ionantha绝对含量Absolutecontent(μg·cm-2)2．41±0．330．26±0．040．37±0．060．38±0．05相对含量Relativecontent(%)70．40±6．257．68±0．6510．89±1．1811．03±1．34—

2.2 空气凤梨叶片蜡质成分分析

根据GC-MS图谱进行分析，各种空气凤梨均可分析出多达40～80种化学成分。将各种化学成分进行归类分析表明，5种空气凤梨叶片蜡质成分中均含有烃类、醇、酮、酯，只有贝可利空气凤梨中还含有少量的酸(表1)。

在烃类的含量上，小精灵空气凤梨中含量最多，且明显高于其余四种。而维路提拉和女王头叶表面蜡质的烃类含量几乎相同，贝克利烃类含量比这两种稍多，电卷烫中烃类含量最少。在醇的含量上，贝可利中的含量最多，且与其余四种空气凤梨有明显差异。其余的四种空气凤梨中都含有少量醇，但没有明显差异。在酮的含量上，五种空气凤梨都较少，且没有明显的差异。含量最多的为小精灵，贝克利、维路提拉、女王头、电卷烫的酮含量依次减少。在酯的含量上，贝克利、维路提拉和女王头上的酯含量比较接近，而电卷烫的酯含量相对最少。

2.3 蜡质总含量与鳞片总面积相关性分析

因空气凤梨叶表面覆盖有白色、蜡质的鳞片，故对各种类的鳞片总面积与叶片蜡质总含量进行了检测与相关性分析。总体来看，5种空气凤梨叶片蜡质总含量：小精灵空气凤梨﹥贝克利空气凤梨﹥维路提拉空气凤梨﹥女王头空气凤梨﹥电卷烫空气凤梨(表2)。小精灵空气凤梨蜡质总含量最高，为3.43 μg·cm-2，其次是贝克利空气凤梨，其含量为3.02 μg·cm-2。电卷烫空气凤梨蜡质总含量最低，为0.59 μg·cm-2，仅约为小精灵空气凤梨蜡质总含量的1/6。而维路提拉空气凤梨和女王头空气凤梨蜡质总含量相差不大，分别为1.73和1.59 μg·cm-2，大约是小精灵空气凤梨蜡质总含量的1/2，是贝克利空气凤梨的3倍左右。

表2 五种空气凤梨叶片蜡质总含量与鳞片总面积

而叶表鳞片总面积小精灵亦为最高，达13.017 cm2，其他依次为贝可利、维路提拉和女王头，电卷烫最低，为4.25 cm2(表2)。可以看出，鳞片总面积越大，蜡质成分总含量越高，Person相关性分析表明，二者在0.01水平上呈显著的正相关，相关性系数为0.96。

3 讨论

相关性分析表明，空气凤梨鳞片总面积与叶片蜡质成分总含量呈显著的正相关，这表明空气凤梨叶片蜡质成分可能主要存在于叶表的鳞片上。从5种空气凤梨的SEM扫描电镜观察中可以看出(图1)，所有空气凤梨叶表面覆盖有密密的鳞片，除电卷烫外，其他空气凤梨表皮细胞和气孔几不可见。这些鳞片，特别是其长长的翼状细胞呈明显的白色、蜡质。而且他人研究也表明，不管是何种类的空气凤梨，其叶表的鳞片均呈白色、蜡质[5～6]。因此，空气凤梨叶片蜡质成分主要存在于叶表鳞片上是不难理解的。

GC-MS分析表明，5种空气凤梨叶片蜡质成分主要为烃类、醇、酮、酯，这与其他植物是有所不同的。模式植物拟南芥的叶表皮蜡质主要组分是超长碳链的次级醇、烷烃和酮，并含有少量的初级醇、酯类、酸和醛[4]。与之相比，酸和醛是空气凤梨中较为缺少的成分。长链脂肪酸是植物蜡质中比较普遍的一种成分，如辣椒和茄子表面蜡质中即含有大量的脂肪酸[10]。而五种空气凤梨中只有贝可利含有少量的酸，其余六种并没有检测到有关酸类的成分。醛类物质是脱羰途径的产物，也是植物蜡质中比较常见的成分，且大多数是具有偶数碳原子的正醛。例如，落地生根近轴端和远轴端叶片内外表皮的蜡质中含有C32-C34醛，占总蜡质含量的3%～7%[14]。但五种空气凤梨叶片蜡质成分中并没有检测到醛类物质。

植物的各器官特性总是与其起源地的气候条件及其生长发育的环境条件相联系的[12]。空气凤梨原产于中南美洲高原，能耐5℃的低温，适宜生长温度为15～25℃[5]。因为其自身特殊的生长条件，大部分空气凤梨起源地的气候条件都是较为干燥的环境。起源地与生长发育条件的不同很可能是空气凤梨叶片蜡质成分不同于一般植物的一大外部因素，是空气凤梨对特殊生境长期适应的结果。

通常，植物的根系是吸收水分和养分的主要器官，但是对于空气凤梨而言，要依赖叶片吸收空气中的水分和养分[5]。空气中的水分毕竟是少量的，是相对干燥的环境，因此绝大多数空气凤梨会受到一定程度的水分胁迫[7]。虽然鳞片也具有多种多样的功能，如反射阳光以保护叶片不受灼伤、减少光呼吸、阻碍动物捕食及病原体侵入以及吸引传粉昆虫等[5,13]，但其主要的功能仍然是吸收水分和防止水分散失。研究表明，蜡质的合成与水分胁迫有紧密的相关性。在干旱条件下小麦灌浆后期叶片蜡质含量与叶片水分利用效率和产量呈显著正相关[14～15]。在水分缺失条件下，豌豆的蜡质含量也有所增加[16]。Oliveira等研究发现，植物表皮水分渗透性与蜡质成分的极性有关，低极性物质能更有效的防止水分散失[17]。本实验中的五种空气凤梨叶片蜡质中含量较多的为低极性的烷烃、醇、酮、酯等(表1)，可起到有效防止水分散失的功能。

当然，不同空气凤梨种类之间叶片蜡质成分也存在着差异，如小精灵中烃类含量最高。烷烃是脱羰途径的主要产物，主要由17个C原子以上的奇数碳原子烷烃组成，是植物中最常见的一类蜡质成分。有研究发现,蜡质中的烃类组分是最有效的保水组分,其次为醇类、醛类、蜡酯等脂肪族类化合物[18]，暗示小精灵空气凤梨在所研究空气凤梨种类中具有较强的保水能力。然而，这还需要对不同种类的空气凤梨进行干旱胁迫实验以获得更多证据支持这一观点。

1.宋超,王婧,郭彦军,等.植物表皮蜡质对环境胁迫的响应[J].植物生理学报,2011,47(10):951-956.

Song C,Wang J,Guo Y J,et al.Response of plant epicuticular wax to environmental factors [J].Plant Physiology Journal,2011,47(10):951-956.

2.Riederer M,Schreiber L.Protecting against water loss:analysis of the barrier properties of plant cuticles[J].Journal of Experimental Botany,2001,52(363):2023-2032.

3.曾琼,刘德春,刘勇.植物角质层蜡质的化学组成研究综述[J].生态学报,2013,33(17):5133-5140.

Zeng Q,Liu D C,Liu Y.The overview and prospect of chemical composition of plant cuticular wax[J].Acta Ecologica Sinica,2013,33(17):5133-5140.

4.Kosma D K,Bourdenx B,Bernard A,et al.The impact of water deficiency on leaf cuticle lipids ofArabidopsis[J].Plant Physiology,2009,151(4):1918-1929.

5.Benzing D H,Bennett B,Brown G,et al.Bromeliaceae:profile of an adaptive radiation[D].Cambridge:Cambridge University Press,2000.

6.王思维,郑桂灵,付英,等.气生凤梨叶片结构研究[J].植物研究,2010,30(2):140-145.

Wang S W,Zheng G L,Fu Y,et al.Foliar structure of several species of epiphyticTillandsia(Bromeliaceae)[J].Bulletin of Botanical Research,2010,30(2):140-145.

7.Martin C E.Physiological ecology of the Bromeliaceae[J].The Botanical Review,1994,60(1):1-82.

8.Calasans C F,Malm O.Elemental mercury contamination survey in a chlor-alkali plant by the use of transplanted Spanish moss,TillandsiausneoidesL.[J].Science of the Total Environment,1997,208(3):165-177.

9.李俊霖,李鹏,王恒蓉,等.特殊植物类群空气凤梨对大气污染物甲醛的净化[J].环境工程学报,2013,7(4):1451-1458.

Li J L,Li P,Wang H R,et al.Purification of air pollutant formaldehyde with special plant group epiphyticTillandsia[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2013,7(4):1451-1458.

10.Bauer S,Schulte E,Thier H P.Composition of the surface waxes from bell pepper and eggplant[J].European Food Research and Technology,2005,220(1):5-10.

11.Van Maarseveen C,Jetter R.Composition of the epicuticular and intracuticular wax layers onKalanchoedaigremontiana(Hamet et Perr.de la Bathie) leaves[J].Phytochemistry,2009,70(7):899-906.

12.王绍辉,张福墁.黄瓜叶表面特性与生态适应性[J].生态学报,2003,23(1):199-204.

Wang S H,Zhang F M.Studies on relationship between the ecophysiological feature and leaf characteri stics of cucumber[J].Acta Ecologica Sinica,2003,23(1):199-204.

13.Pierce S,Maxwell K,Griffiths H,et al.Hydrophobic trichome layers and epicuticular wax powders in Bromeliaceae[J].American Journal of Botany,2001,88(8):1371-1389.

14.高爱丽,赵秀梅,秦鑫.水分胁迫下小麦叶片渗透调节与抗旱性的关系[J].西北植物学报,1991,11(1):58-63.

Gao A L,Zhao X M,Qin X.Relationship between osmotic adjustment and drought resistance in wheat under water stress[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,1991,11(1):58-63.

15.李德全,邹琦,程炳嵩.冬麦叶片的渗透调节能力与产量及抗旱性的关系[J].植物学报,1996,13(增刊):46-50.

Li D Q,Zhou Q,Cheng B H.Osmotic adjustment ability of winter wheat leaves and relation to yield and drought resistance[J].Chinese Bulletin of Botany,1996,13(zk):46-50.

16.郭彦军,倪郁,郭芸江,等.空气湿度与土壤水分胁迫对紫花苜蓿叶表皮蜡质特性的影响[J].生态学报,2011,31(18):5273-5280.

Guo Y J,Ni Y,Guo Y J,et al.Effects of air humidity and soil water deficit on characteristics of leaf cuticular waxes in alfalfa(Medicagostaiva)[J].Acta Ecologica Sinica,2011,31(18):5273-5280.

17.Oliveira A F M,Meirelles S T,Salatino A.Epicuticular waxes from caatinga and cerrado species and their efficiency against water loss[J].Anais da Academia Brasileira de Ciências,2003,75:431-439.

18.Kolattukudy P E.Plant waxes[J].Lipids,1970,5(2):259-275.

Qingdao Science and Technology Program(14-2-4-46-jch);National Natural Science Foundation of China(41475132,41571472);Scientific Foundation of Qingdao Agricultural University(1113351,1115002)

introduction：ZHENG Gui-Ling(1980—),female,Ph.D,major in botany.

date:2016-05-04

LeafWaxComponentsandSurfaceStructureofTillandsiaSpecies

ZHENG Gui-Ling ZHANG Wei LI Peng*

(College of Resource and Environment,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109)

Tillandsiais a kind of special plant which absorbs water and nutrients directly from the air through leaves. In order to investigate the function of the leave, fiveTillandsiaspecies were chose to analyze their leave surface structures with scanning electron microscope(SEM) and wax components with gas chromatography-mass spectrometry technology(GC-MS). The white, waxy, sunflower-shaped trichomes covered the leaf surface in all species. The foliar trichomes were made up of disc cells, ring cells and wing cells. The main wax components contained low-polarity constituents, including hydrocarbons, alcohols, ketones and esters, which may reduce the water loss effectively. In addition, the total contents of wax components among fiveTillandsiaspecies were different with the order ofTillandsiaionantha>Tillandsiabrachycaulos>Tillandsiavelutina>Tillandsiamedusa>Tillandsiastreptophylla. By the correlation analysis, the total contents of wax components were positively correlated with the total leave area of foliar trichomes, indicating that those wax components were distributed mainly on the foliar trichomes.

air plant;foliar trichomes;GC-MS;wax components

青岛市科技计划项目(14-2-4-46-jch)；国家自然科学基金项目(41475132，41571472)；青岛农业大学高层次人才基金项目(1113351，1115002)

郑桂灵(1980—)，女，博士，主要从事植物学研究。

* 通信作者：E-mail:pengleep@163.com

2016-05-04

* Corresponding author：E-mail:pengleep@163.com

S668.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.009