外源硝态氮水平对长春花生理代谢的影响

朱孟炎 于博帆 陈华峰

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

外源硝态氮水平对长春花生理代谢的影响

朱孟炎 于博帆 陈华峰*

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

以长春花为实验材料，采用珍珠岩为培养基质，设置不同氮素浓度，对其各器官的初生和次生代谢进行了初步研究,结果如下：植株中3种主要生物碱含量均是随着外源氮水平的降低而降低，外源硝态氮水平对长春花文朵灵和长春质碱在不同叶位叶片中的积累特点影响较明显，而对长春碱的积累影响较小。在高氮条件下，植物体内合成和积累较高水平的游离氨基酸，可能为部分生物碱的合成提供了骨架，并能促进生物碱含量的提高。蔗糖含量在不同叶位叶片中也是随着叶龄的增加而缓慢增加。同时，高氮水平下，叶片中蔗糖含量明显高于正常供氮水平下的含量。本研究为提高长春花中具有重要药用价值生物碱的含量提供参考依据。

长春花；硝态氮；物碱；次生代谢

氮元素(N)是植物生长和发育的必须营养元素，也是植物发育过程中重要的限制因素[1]，主要以硝态氮(nitrate)和氨态氮(ammonium)两种形式被植物所吸收利用。这两种形态的氮在植物的生长和代谢过程中发挥着重要作用，其中硝态氮是自然界大多数植物吸收氮的主要形式[2]。硝酸盐既是营养成分，也是氮代谢的主要调控因子，指导植物的碳流向，合成有利于碳同化生成氨基酸的化合物，它对植物生长和新陈代谢有着重要的影响[3]。研究表明，为植物提供较高水平的硝态氮，会对植物地上部生长起到积极的促进作用，同时也推迟了植物衰老进程[4]。氮素通常是作物生产中的主要限制因子[5]。虽然工业化的氮肥生产解决了土壤—植物之间的氮素供需矛盾,但由于人们片面追求高产,盲目大量施用氮肥,一定程度上使作物产量有所提高,但也造成了人力资源浪费,同时带来诸多弊端如经济效益下降,利用率下降,环境污染,生态环境条件恶化[6]。植物次生代谢产物的环境调控近年来颇受人们关注,也有研究报告光对植物次生代谢过程的影响,如对银杏中的黄酮苷、高山红景天中的红景天苷、喜树中的喜树碱等次生代谢产物的影响等，但将氮素与可溶性糖联系起来对长春花碱的研究不多[7～9]。为了在人工栽培长春花过程中提高氮素利用率,并保证目的生物碱含量稳定提高，本研究围绕外源氮水平对长春花利用氮素的生理生化特性及氮素对植物生理生化代谢进程的影响，研究氮素水平对长春花生理生态学，特别是次生代谢产物积累的影响，同时分析了氮素水平对不同叶位文朵灵、长春质碱和长春碱含量积累的影响，以及氮素水平对不同叶位中可溶性及游离氨基酸积累的影响。

1 材料与方法

试验于2014年3月上旬～7月下旬在东北林业大学森林生态教育部重点实验室内进行。试验植株为播种于本试验室温室中的长春花。长春花种子萌发后形成的幼苗置于人工气候箱(CONV IRON,Canada)中进行对照培养[10]。根据长春花幼苗光合作用的特点，气候箱设置为(500±10) μmol·m-2·s-1，光照时间6:00～18:00，培养条件为温度28℃，湿度60%左右。浇灌Hoagland营养液培养。待长春花幼苗出现4对叶片时开始进行光强胁迫试验，从培养箱选取长势相近的幼苗转入人工培养架上，分为3个营养梯度，低氮水平(6 mmol·L-1nitrate)中氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)，培养3周后取样,进行形态学和生理学参数测定，重复次数分别为3次。在此试验的基础上，对比正常氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)培养6周情况下，长春花不同叶位初生和次生代谢产物的影响，以揭示植物在不同氮水平条件下如何分配体内能量和物质。

2 结果与分析

2.1 外源硝态氮水平对长春花生物碱含量的影响

对比外源氮水平对长春花叶片和叶柄中文朵灵、长春质碱和长春碱含量的影响特点(图1)。图1可以看出，不管是叶片中还是叶柄中三种主要生物碱含量均是随着外源氮水平的降低而降低[11]。在低氮水平下，植物叶片中三种主要生物碱含量，包括文朵灵、长春质碱和长春碱，均显著低于正常和高氮水平。但高氮水平条件下，植物叶片中生物碱含量与正常氮水平下无显著差别，但叶柄中长春碱含量在高氮水平下显著高于正常和低氮水平下的含量。

由图2可知，根部检测出长春质碱含量达到3 mg·g-1DW，显著高于叶片中长春质碱含量。同时低氮水平下，其含量显著低于其它两种氮水平下。

2.2外源硝态氮水平对长春花不同叶位生物碱含量的影响

由图3可知，在正常氮水平条件下，长春花叶片中文朵灵和长春质碱含量虽然总体上随着叶片由幼嫩向成熟变化而呈降低的趋势，但差异不大；长春碱的含量在不同叶位中分布趋势性不明显。

高氮水平条件下，长春花叶片中文朵灵和长春质碱含量在不同叶位中均明显高于正常供氮条件，同时也随着叶龄的增加而线性降低；长春碱含量在第四对叶片中最高，表明长春碱优先积累在成熟叶片中，幼嫩叶片中含量次之。

总体上看，外源硝态氮水平对长春花文朵灵和长春质碱在不同叶位叶片中的积累特点影响较明显，而对长春碱的积累影响较小[12]。

2.3外源硝态氮水平对长春花不同叶位游离氨基酸含量的影响

植物生物碱的合成和积累与游离氨基酸密切相关。供氮水平的改变能影响植物叶片中氨基酸的积累，因此对不同叶位中游离氨基酸含量进行检测，以观察不同氮水平对氨基酸含量的影响特点。

脯氨酸是研究较多的植物渗透调节物质，一般与渗透胁迫等逆境响应密切相关。结果显示，脯氨酸随着叶片年龄的增加而呈趋势性下降的特点，特别是第四对叶片中脯氨酸含量在正常和高氮水平条件下均显著低于其它叶位叶片的含量。另外，高氮水平条件下，较幼嫩叶片(第一和第二对)中脯氨酸含量显著高于正常氮水平条件下的对照叶片。

图1 外源氮水平对长春花叶片和叶柄中文朵灵、长春质碱和长春碱含量的影响 A.文朵灵；B.长春质碱；C.长春碱Fig.1 Effects of exogenous nitrate levels on vindoline,catharanthine and vinblastine contents in Catharanthus leaf and leafstalk A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

图2 外源氮水平对长春花根中长春质碱含量的影响Fig.2 Effects of exogenous nitrate levels on Catharanthus catharanthine contents in roots

谷氨酸是植物中重要的转运和储存氮元素的氨基酸之一，也是脯氨酸等化合物合成的前体。由图4可知，在正常或高氮水平下，谷氨酸与脯氨酸在不同叶位中的分布情况相反，它随着叶龄增加而增加，在成熟叶片中含量最高，是前三对叶片中含量的2倍左右[13]。

不同叶位叶片中总游离氨基酸含量与游离氨的含量变化趋势相似，均随着叶龄增加而呈明显下降趋势，该趋势在高氮水平条件下更加显著。同时，高氮条件下，不同叶位叶片中的总游离氨基酸含量与游离氨均显著高于正常供氮条件。可以看出，游离氨的含量对总游离氨基酸含量的提高具有一定的促进作用。

相关性分析表明，总游离氨基酸含量与游离氨在不同叶位中的分布情况与文朵灵及长春质碱含量变化特点相关性显著(P<0.05)。由于生物碱是含氮化合物，在高氮条件下，植物体内合成和积累较高水平的游离氨基酸，可能为部分生物碱的合成提供了骨架，能促进生物碱含量的提高。

图3 不同供氮水平对长春花不同叶位叶片中3种生物碱含量的影响 A.文朵灵；B.长春质碱；C.长春碱Fig.3 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of three kinds of alkaloids in C.roseus leaves A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

图4 不同供氮水平对长春花不同叶位叶片中游离氨基酸含量的影响 A.脯氨酸；B.谷氨酸；C.游离氨基酸；D.游离氨Fig.4 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in C.roseus leaves A.Proline; B.Glutarmate; C.Free amino acide; D.Ammonium

2.4外源硝态氮水平对长春花不同叶位可溶性糖含量的影响

由图5可知，长春花葡萄糖含量在不同叶位中差异不显著，但高氮水平下，不同叶位叶片中葡萄糖的含量均显著高于正常供氮水平。

正常供氮水平条件下，长春花叶片中果糖含量随着叶龄增加而线性提高，但在高氮水平下，不同叶位叶片中果糖含量变化不显著，并明显低于正常供氮水平下不同叶片中的含量。果糖含量在叶片中能反映植物衰老的情况，正常供氮情况下，由于氮源有限，因此植物将固定的能量和物质优先分配于幼嫩叶片中，果糖较低。而在高氮水平下，由于植物氮资源较丰富，延缓了叶片的衰老进程，因此叶片中果糖含量变化不显著。

蔗糖含量在不同叶位叶片中也是随着叶龄的增加，而缓慢增加，第4对叶片中的蔗糖含量达到最高值。同时，高氮水平下，叶片中蔗糖含量明显高于正常供氮水平下的含量。原因可能是，较丰富的氮资源促进了植物光合作用，提高了植物碳固定量，蔗糖作为碳水化合物转运的重要分子，因此在高氮水平下其含量呈现上升趋势。

图5 不同供氮水平对长春花不同叶位叶片中可溶性含量的影响 A.葡萄糖；B.果糖；C.蔗糖Fig.5 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in different leaf position leaves of C.roseus A.Glucose; B.Fructose; C.Sucrose

2.5外源硝态氮水平下长春花不同叶位初生和次生代谢物质含量之间相关性分析

为了揭示长春花主要三种生物碱积累受不同氮水平和发育阶段的调控特点，我们对所有数据进行了相关性分析(n=40)。由表1可知，文朵灵与长春质碱含量显著相关，同时这两种生物碱与总游离氨基酸、脯氨酸及游离氨之间呈现极显著相关性(P<0.01)。但长春碱积累与其它代谢物质积累之间相关性不显著。

表1长春花不同叶位叶片中三种生物碱含量与其它代谢物质含量的相关性分析

Table1CorrelationanalysisbetweenthreekindsofalkaloidswiththeothermetabolitesindifferentlypositionalleavesofC.roseus

注：*表示显著水平小于0.05;**表示显著水平小于0.01。

Note：*Correlation is significant at the 0.05 level;**Correlation is significant at the 0.01 level.

3 讨论

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1．稿件可用中英文两种语言撰写。按以下顺序书写：题目(一般不超过20字)、作者姓名(署名不宜超过6位)、作者单位(附所在城市和邮编)、摘要、关键词(3～8个)、中图分类号、文献标识码。英文题目、作者姓名(汉语拼音)、作者单位(英文)、英文摘要、关键词、正文、致谢(可无)、参考文献、图版说明。中英文摘要应详细概括目的、方法、结果和主要结论。

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《植物研究》编辑部

National Natural Science Foundation of Youth Science Foundation(31400337)

introduction：ZHU Meng-Yan(1991—),female,senior engineer,mainly engaged in plantphysiology research work.

date:2016-01-15

EffectsofNitrateNitrogenLevelsonPhysiologicalMetabolismofCatharanthusroseus

ZHU Meng-Yan YU Bo-Fan CHEN Hua-Feng*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

WithCatharanthusroseus, we used perlite as culture substrate to study the biomass and secondary metabolism. Three main alkaloids in plants were decreased with reduced levels of nitrogen. The level of exogenous nitrate on vindoline and Catharanthine inC.roseuswas with more significant accumulation in the leaves at different leaf positions, but with little effect on the accumulation of vinblastine. In high nitrogen condition, the plant synthesis and accumulation were at higher levels of free amino acids, which may provide the skeleton and promote the improvement of alkaloids in the partial synthesis. The content of sucrose in different position leaves was increased slowly with the increase of age. The content of sucrose in leaf at higher nitrogen level was significantly higher than that at normal nitrogen level. This research provide the reference basis that the important medicinal value for improving the content of alkaloid.

Catharanthusroseus;nitrate nitrogen;alkaloid;secondary metabolism

国家自然科学基金青年科学基金项目(31400337)

朱孟炎(1991—)，女，硕士研究生，主要从事植物生理生态学研究工作。

* 通信作者：E-mail:biginsect2002@163.com

2016-01-15

* Corresponding author：E-mail:biginsect2002@163.com

S143.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.008