拟南芥AtJ3与PKS5相互作用参与植物ABA响应

赵菲佚 焦成瑾 陈 荃 贾 贞 王太术 周 辉

(天水师范学院生物工程与技术学院，天水 741000)

拟南芥AtJ3与PKS5相互作用参与植物ABA响应

赵菲佚 焦成瑾 陈 荃 贾 贞 王太术 周 辉

(天水师范学院生物工程与技术学院，天水 741000)

脱落酸(abscisic acid，ABA)在植物生长、发育及环境胁迫响应中有着广泛的作用。前期研究已鉴定了诸多参与植物ABA信号转导的元件。本研究以拟南芥(Arabidopsisthaliana)蛋白激酶PKS5(SOS2-like protein kinase 5)为诱饵蛋白，使用酵母双杂交筛选到与PKS5相互作用的蛋白分子伴侣AtJ3(Arabidopsis thaliana DnaJ homolog 3)。AtJ3 T-DNA突变体atj3-1与atj3-2表现出萌发期ABA表型。在外源ABA处理下，atj3-1与atj3-2种子发芽率降彽、幼苗黄化、生长矮小。atj3-1与PKS5双突变体atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4表现出与AtJ3或PKS5突变体相同的ABA表型。亚细胞定位与转基因研究显示AtJ3与PKS5有相同的表达模式。免疫共沉淀与体外磷酸化测试确认AtJ3与PKS5存在相互作用并抑制PKS5激酶活性。研究结果表明：AtJ3与PKS5相互作用，通过抑制PKS5激酶活性共同参与植物ABA信号响应过程。

ABA响应；AtJ3；相互作用；磷酸化活性抑制；PKS5

植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)在植物的整个生活周期中起着关键性的作用。已有研究表明：ABA参与植物胚胎发育、种子成熟与休眠、根与茎的生长及叶面蒸腾[1～3]。此外，ABA还介导了植物对外界各种胁迫的响应，如干旱或渗透诱导的气孔关闭及盐、低氧、冷、伤害或病理等信号诱导的抗性[4]。对植物ABA响应信号途径中作用元件的鉴定与作用机理解析已成为植物激素研究的重要内容。

PKSes(SOS2-like protein kinases)蛋白激酶属于拟南芥SnRK3(SNF1-related kinase3)家族[5～6]。该家族中，PKS12在调节ABA与冷信号中起作用[7]。在植物萌发和幼苗期，PKS18参与ABA响应。PKS18T/D(PKS18组成型表达形式)转基因植物显示出对ABA的超敏感性，而该激酶RNAi转基因植物对ABA不敏感[8]。PKS3(SOS2-like protein kinase 3)与SCaBP5(SOS3-like calcium binding protein 5)存在相互作用。pks3或scabp5在种子萌发、幼苗生长和气孔关闭上表现出对ABA的超敏感性[9]。PKS24不仅在PHYA(phytochrome A)介导的抑制拟南芥远红光黄化苗转绿过程中起作用[10]，也在盐及ABA的胁迫应答中具有功能[11]。

PKS5为PKS家族26个成员之一。PKS5通过磷酸化AHA2(质膜ATPase的等位形式之一)第931位丝氨酸而阻止其与14-3-3蛋白相互作用，对AHA2活性进行负向调控，导致植物对外源高pH具有抗性[12]。近期发现，PKS5可与SCaBP8(SOS3-like calcium binding protein 8)相互作用，通过磷酸化AHA2参与植物对外界盐碱的响应过程[13]。此外，PKS5可对植物抗病途径中一个主要共激活子NPR1(Nonexpressor of Pathogenesis-Related gene 1)的磷酸化介异WRKY38(WRKY DNA-binding protein 38)与WRKY62(WRKY DNA-binding protein 62)的表达，参与植物抗病过程[14]。

植物存在由高温、高盐、渗透等胁迫因素诱导产生的含J结构域的DnaJ蛋白[15～17]。大多数DnaJ蛋白在一级结构上包含1个由70个氨基酸组成的J结构域、相邻G/F结构域和末端锌指(CxxCxGxG)结构域[18～19]。在二级结构上，J结构域含有四个螺旋和一个位于第2和第3螺旋间的由His、Pro和Asp三肽组成的高度保守环形区[20]。J结构域与热激蛋白Hsp70(Heat shock protein 70)的结合可稳定Hsp70与底物的相互作用[21]。DnaJ蛋白在进化上具有保守性。除了在细胞蛋白的翻译、折叠、解折叠、移位及降解过程中作为蛋白分子伴侣起着重要作用外，还可直接结合于转录因子对转录激活进行调控。此外，DnaJ在核内体形成和类胡萝卜素积累中也具有功能[15～17]。拟南芥中存在89个含J结构域的蛋白[22]，AtJ3分子伴侣为其中之一。拟南芥AtJ3介导开花信号的整合，对植物开化时间进行调控[23～24]。AtJ3也可作为正向调节子对质膜上质子泵活性进行调节，从而参与植物对外源盐碱胁迫的响应[25]。已发现部分PKS家族成员参与植物ABA响应，PKS5及与其有相互作用的AtJ3是否也在ABA信号途径中起作用目前未见报道。

本研究使用AtJ3与PKS5突变体，对两者在外源ABA处理下的表型进行了考察，并对两者在ABA响应中可能的作用机理进行了探讨。研究结果为ABA信号途径鉴定了新的参与元件，并为AtJ3与PKS5调控ABA信号机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟南芥野生型(Col-0)、T-DNA突变体pks5-1(SALK_108074)、atj3-1(SALK_131923)和atj3-2(SALK_141625)订购自SALK。pks5-3与pks5-4为TILLING点突变体(http://tilling.fhcrc.org:9366)，订购自ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)。大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)及研究中所用质粒载体均为本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

本研究中除用于植物点突变鉴定引物外，其余引物使用Primer Premier 5.0软件进行设计，在上海生物工程公司合成(表1)。

1.2.2 植物突变纯合体鉴定

atj3-1、atj3-2与pks5-1突变纯合体鉴定正向引物分别为A31TF、A32TF及P5TF,反向引物使用T-DNA左边界引物Lba1与LBb1。pks5-3与pks5-4点突变纯合体鉴定使用衍生型酶切扩增多态性序列(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS)分子标记技术。点突变鉴定引物使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计。pks5-3使用P53CF与P53CR引物对，PCR扩增263 bp片段，AvaⅠ内切酶切野生型扩增产物。pks5-4使用P54CF与P54CR引物对，PCR扩增236 bp片段，MluⅠ内切酶切野生型。双突变纯合体atj3-1atj3-2、atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3、atj3-1pks5-4和pks5-3pks5-4分别使用各单突变纯合体进行杂交，并经PCR与测序鉴定获得。

1.2.3 植物培养条件及ABA表型观察

试验种子用消毒液(20%次氯酸钠+0.1% Triton X-100)在EP管中灭菌10 min，灭菌ddH2O洗5次后点种于MS或含0.3 μmol·L-1ABA的处理MS固体平板上。处理MS平板在4℃下春化2 d后置于16 h光(22℃)/8 h暗(20℃)光周期条件下进行培养。培养一定时间(9或12 d)后，对平板上种子萌发率进行统计，并观察幼苗ABA表型。

表1 引物序列

注：序列中下划线为限制性酶作用位点碱基。

Note:The underlines in the primer sequences indicate the base pairs of the restriction endonucleases.

1.2.4 RNA分离及RT-PCR分析

拟南芥野生型(Col-0)；atj3-1、atj3-2、pks5-1突变体总RNA提取使用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(上海生物工程公司，SK8661)进行。提取总RNA使用Promega公司M-MLV反转录酶(Promega，M1705)在42℃下进行反转录，获得cDNA第一链。植物总RNA提取及cDNA第一链合成操作按各自试剂盒推荐方法进行。为确认atj3-1及atj3-2中AtJ3的表达，以Col-0、atj3-1、atj3-2、pks5-1的cDNA第一链为模板，使用AtJ3的CDS全长引物A3F与A3R进行RT-PCR，同时以ACTIN2为内参，Act2F与Act2R为内参引物，PCR为25个循环。

1.2.5AtJ3及PKS5点突变序列克隆与蛋白原核表达

PKS5序列克隆以野生型(Col-0)及pks5-3、pks5-4各点突变体基因组DNA为模板，以P5H与P5R为引物对，PCR扩增得到野生型及点突变PKS5编码序列。BamHⅠ与EcoRⅠ酶切PCR扩增产物与pET28a(Novagen，69864-3)原核表达载体，胶回收纯化后使用连接酶(NEB，M0202S)进行连接。AtJ3编码序列使用引物A3F和A3R，以AtJ3 cDNA为模板。PCR扩增产物与pET28a使用BamHⅠ与SalⅠ酶切，胶回收纯化后使用连接酶(NEB，M0202S)进行连接。构建载体转化大肠杆菌DH5α。阳性候选克隆送上海生物工程公司测序验证。原核表达载体经测序验证后从DH5α提取质粒以电击转化方法转入BL21(DE3)表达菌株，再次经PCR筛选得到阳性克隆后保存备用。

含目标蛋白表达载体的BL21(DE3)菌株按1∶1 000的比例接入含30 μg·L-1氯霉素和50 μg·L-1的卡那霉素的60 mL液体LB培养基中，并于37℃过夜小量培养。次日将10 mL过夜培养物转入1 L含50 μg·mL-1Kan的LB培养基中继续培养，当菌液OD600达0.7时收菌，离心后沉淀加入30 mL裂解液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl,10 mmol·L-1imidazole,pH 8.0)重悬，在超声破碎仪(VCX130,SONICS)上破碎(250 W,超声3 s,间隔3 s,1 min循环,共5 min)后离心，上清液中加入100 μL Ni-NTA树脂(Qiagen，No.30210)进行蛋白结合，最后使用洗脱缓冲液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1imidazole,pH 8.0)洗脱得到目标蛋白。后续融合蛋白纯化方法按Qiagen公司的树脂提取方法进行。结合于树脂上的重组蛋白保存于4℃冰箱中备用。

1.2.6 PKS5点突变重组蛋白体外激酶活性测试

激酶体外磷酸化试验按照以下方法进行。冰浴EP管中混合激酶与底物蛋白MBP(Myelin Basic Protein)，反应体积为20 μL，计算激酶反应缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl,pH7.2， 5 mmol·L-1MgCl2,0.5 mmol·L-1CaCl2,10 μmol·L-1ATP,2 mmol·L-1DTT)的用量，每个反应使用2 μCi(γ-32P)ATP。将反应所需体积的重组蛋白加入激酶反应缓冲液中，30℃水浴中反应30 min后加入6×SDS蛋白上样缓冲液，并在干浴器(SBH130D/3,Stuart)上95℃加热5 min。离心后于12%的SDS蛋白胶上进行变性电泳，考马斯亮蓝染色后在脱色液中脱色，凝胶成像仪上(GelDoc-It2 310，UVP)照相后使用保鲜膜包好蛋白凝胶，压于磷屏上，次日于磷屏成像仪(STORM 860，Amersham Biosciences)上进行成像。

1.2.7AtJ3与PKS5荧光融合蛋白在原生质体与转基因植物中的亚细胞定位观察

使用引物AGF与AGR，以野生型(Col-0)cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物克隆至pCAMBIA1205-GFP植物转化载体上，构建植物GFP-AtJ3绿色荧光融合蛋白表达载体。使用引物PYF与PYR，以野生型(Col-0)基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆至pTA7002植物表达载体上，构建植物PKS5-YFP黄色荧光融合蛋白表达载体。测序正确的植物荧光表达载体经质粒纯化试剂盒Maxprep Kit(Vigorous Biotechnololgy)纯化后，分别转化拟南芥野生型(Col-0)原生质体与植物中。原生质体转化使用Jen方法进行[26]。pCAMBIA1205-GFP-AtJ3转化的原生质体及生长5 d的T2代转基因植物用于AtJ3亚细胞定位。PTA7002-PKS5-YFP转化的原生质体及生长5 d的T2代转基因植物使用10 mmol·L-1DEX(dexamethasone)处理24 h后在confocal显微镜(Zeiss 510 META)下进行GFP-AtJ3与PKS5-YFP荧光观察。

1.2.8 酵母转化及双杂交试验

以P5YF和P5YR为引物对，拟南芥野生型(Col-0)基因组为模板，PCR扩增PKS5蛋白编码序列并克隆至酵母载体pGBT9上作为诱饵蛋白，对定购自ABRC的50 μg酵母质粒猎物库进行筛选。为验证AtJ3与PKS5相互作用，使用引物A3YF和A3YR；T1YF和T1YR；S1YF和S1YR，以拟南芥野生型(Col-0)cDNA为模板，分别扩增AtJ3、TTG1(TRANSPARENTTESTAGLABRA1)与SCaBP1(SOS3-likecalciumbindingprotein5)蛋白编码序列并克隆至酵母表达载体pGAD10上。酵母表达载体以试验组合共转化至酵母菌株PJ69-4A中。酶母转化、筛库操作与相互作用试验按Clontech公司酵母操作手册进行。

1.2.9蛋白原生质体表达与免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,Co-IP)试验

使用引物P5PF和P5PR；A3PF和A3PR；S1PF和S1PR，以拟南芥野生型(Col-0)基因组或cDNA为模板，PCR分别扩增PKS5、TTG1、AtJ3与SCaBP1蛋白编码序列并克隆至pCAMBIA1307-3xFLAG植物转化载体上与FLAG标签N端转译融合。使用BamHⅠ与SalⅠ双酶切从pET28a-PKS5或pET28a-AtJ3切下PKS5或AtJ3蛋白编码序列，亚克隆至pCAMBIA1307-6xMyc植物转化载体上与Myc标签C端转译融合。构建载体以不同组合转化拟南芥野生型(Col-0)原生质体中进行蛋白表达。原生质体转化使用Jen方法进行[26]。Co-IP按Quan的方法进行[27]。

2 结果与讨论

2.1 AtJ3、PKS5基因与蛋白结构及突变位置

AtJ3定位于拟南芥基因组第三条染色体上(At3g44110)，基因全长1.95 kB，包含6个外显子和5个内含子(图1:A)，从SALK订购得到AtJ3的两个等位突变体，被命名为atj3-1(SALK_132923)和atj3-2(SALK_141625)，T-DNA分别插入第4与第6个外显子上。AtJ3的CDS长度为1 263 bp，编码含420个氨基酸的蛋白质，预测大小为46.31 kD，蛋白含J(14-72)、G/F(82-107)、Zn(135-221)及C(234-358)4个结构域(图1:B)。

PKS5定位于拟南芥第二条染色体上(At2g30360)，其CDS共有1 308个碱基，不含内含子。编码蛋白含有435个氨基酸，为一丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。整个蛋白由位于N端的激酶结构域和C端的激酶调控域[28]组成。激酶结构域内含有一个推测的激活环(KDAL)，调控结构域内含有两个子结构域，FISL基序和PPI结构域。FISL结构域是PKS家族中保守的结构域，是与SCaBP(SOS3-like calcium binding protein)相互作用所必须的结构域[8]。在激酶结构域和FISL基序之间由连接结构域(JK)进行连接[29]。从SALK与ABRC获得PKS5不同类型突变体。pks5-1为T-DNA插入突变体，pks5-3发生了c-t的转换，蛋白第168位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸(A168V)；pks5-3突变位于已知的激酶激活环内，pks5-4发生了c-t的突变，第317位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸(S317L)；pks5-4的突变位于FISL基序内(图1:C)。

图1 AtJ3、PKS5基因与蛋白结构 A. AtJ3基因结构(方框表示外显子；黑色棒表示内含子；三角形指示AtJ3 T-DNA插入位置)；B. AtJ3蛋白结构(方框表示不同结构域；J. J结构域；G/F. 结构域；Zn. 锌指结构域；C. C末端结构域；数字表示从转译起始点计各结构域氨基酸位置)；C. PKS5蛋白结构与突变位置(KDAL. 激酶催化结构域激活环；JK. 连接区；FISL. FISL基序；PPI. 与PP2C蛋白磷酸酶作用结构域；箭头指示各点突变位置；三角形指示PKS5 T-DNA插入位置)Fig.1 Schematic diagrams of genes and proteins of AtJ3 and PKS5 A. Structure of the gene AtJ3(Boxes show extrons; solid bars signify introns; Triangles show the T-DNA insertion sties in atj3-1(SALK_132923 and atj3-2(SALK_141625); B. Diagram of the protein AtJ3(Boxes show various domains of AtJ3; J, G/F, Zn and C show the domain of J,G/F,CXXCXGXG zinc finger and C-terminus, respectively); C. Structure and mutant sites of the protein PKS5(KDAL. KDAL activation loop; JK. Conjunction domain; FISL. FISL motif; PPI. Domain interacted with the PP2C phosphorase; The solid black arrows indicate the point mutant positions of PKS5 and the T-DNA insertion site is marked with the triangle)

图2 PKS5点突变磷酸化活性比较 A. PKS5-3和PKS5-4较PKS5有较高的磷酸化活性(MBP.麦芽糖结合蛋白；CBB.考马斯亮蓝染色；AUD.放射自显影)；B. PKS5,PKS5-3和PKS5-4相对磷酸化活性Fig.2 Comparison of phosphorylation activity of PKS5 point mutant proteins A. PKS5-3 and PKS5-4 had higher kinase activity compared with PKS5(MBP. Myelin Basic Protein; CBB. Coomassie blue stain; AUD. Autoradiograph); B. Relative phosphorylation activity of PKS5,PKS5-3 and PKS5-4

2.2 PKS5不同结构域点突变体外激酶活性测试

为考察PKS5不同结构域发生点突变后各突变激酶活性变化，对PKS5不同的点突变CDS进行克隆并在原核中表达。不同PKS5点突变重组蛋白的激酶活性比较如图2A所示。结果显示，不同的PKS5点突变激酶活性发生改变，与PKS5对照相比较，PKS5-3与PKS5-4活性增高，其中PKS5-3活性最高。PKS5点突变激酶底物磷酸化(MBP)活性与自磷酸化活性变化一致(图2:B)。此结果说明：PKS5不同结构域发生突变对PKS5激酶活性的影响不同。PKS5-3突变发生于激酶激活环内(KDAL)，PKS5-4突变发生于FISL基序内。KDAL突变对激酶活性影响要大于FISL内突变。从PKS5点突变激酶活性可得知，与PKS5野生型相比较，拟南芥PKS5突变体pks5-3与pks5-4为功能获得性突变体。

图3 pks5点突变体ABA表型 A. pks5点突变体pks5-3与pks5-4生长12 d的ABA敏感表型；B. pks5-3与pks5-4杂交一代生长9 d表现出与亲代相似的ABA敏感表型；C.不同ABA浓度下pks5点突变体萌发率曲线Fig.3 ABA phenotypes of pks5 point mutants A. pks5 point mutants display ABA sensitive phenotypes after 12d growth; B. F1 generation of cross of pks5-3 and pks5-4 has similar ABA phenotypes as the parents after 9 d growth; C. The germination curve of pks5 point mutants under gradient ABA

图4 AtJ3与PKS5存在相互作用 A. AtJ3与PKS5在酵母中相互作用验证(SC-LW.缺乏亮氨酸与色氨酸的合成完全培养基；SC-LWH+3-AT.缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸并含20 mmol·L-13-氨基-1，2，4-三唑的合成完全培养基；X-Gal. SC-LWH+3-AT平板上酵母β-半乳糖苷酶活性试验；SCaBP1,TTG1.正负对照；X10,X100.酵母培养液稀释倍数)； B.体内AtJ3与PKS5存在相互作用(Myc. Myc标签；FLAG. FLAG标签；TTG1.对照)； C. AtJ3-GFP在原生质体(上部)与转基因植株(下部)中的定位；D. YFP-PKS5在原生质体(上部)与转基因植株(下部)中定位Fig.4 AtJ3 physically interacted with PKS5 A. Verification of interaction of AtJ3 and PKS5 in yeast(SC-LW. Synthetic complete medium without Leu and Trp; SC-LWH+3-AT. Synthetic complete medium without Leu,Trp and His and with 20 mmol·L-1 3-amino-1,2,4-triazole；X-Gal. β-galactosidase assay for yeast cells grown in the SC-LWH+3-AT plate；SCaBP1,TTG1. Indicate the positive and negative control,respectively; X10,X100. Show the serial diluted culture of yeast cells); B. Co-IP assay of AtJ3 and PKS5 in vivo(Myc. Myc tag；FLAG. FLAG tag；TTG1. Control); C. Localization of AtJ3-GFP in protoplasts(top panel) and transgenic lines(bottom panel); D. Localization of YFP-PKS5 in protoplasts(top panel) and transgenic lines(bottom panel)

2.3 pks5-3与pks5-4萌发期ABA表型

为考察PKS5突变体是否具有ABA表型，对PKS5点突变体pks5-3、pks5-4和PKS5的T-DNA突变体pks5-1的ABA表型进行测试(图3)。结果显示：pks5-3和pks5-4在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上表现出ABA敏感表型，萌发率与野生型相比较降低，幼苗生长矮小，黄化(图3:A)。而pks5-1在此条件下与野生型比较不显示ABA敏感表型。将pks5-3与pks5-4进行杂交，F1子代在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上表现出与亲代相似的ABA敏感表型，但其对ABA的敏感性增加(图3:B)。pks5-3与pks5-4在不同ABA浓度下萌发率曲线表明：pks5-3与pks5-4在不同ABA浓度下的萌发率随着ABA浓度的升高而降低，在0.15～0.75 μmol·L-1ABA浓度区间内，pks5-4较pks5-3具有较高的萌发率(图3:C)。pks5功能获得性点突变体ABA表型说明：PKS5参与ABA响应途径，为ABA信号转导的元件之一。

2.4 AtJ3与PKS5的相互作用

为获得与PKS5相互作用元件，将PKS5的CDS克隆至pGBT9酵母表达载体上，以PKS5为诱饵蛋白筛选拟南芥cDNA文库。筛选到编码DnaJ类似热激蛋白AtJ3。为确认PKS5与AtJ3间的相互作用，将AtJ3的CDS克隆至pGAD10酵母载体上，与PKS5酵母载体共转入酵母菌株PJ69-4A中，在筛选培养基上验证PKS5与AtJ3间的相互作用。图4A结果表明PKS5与AtJ3在酵母中的确存在相互作用。为进一步确认PKS5与AtJ3在植物体内的相互作用，构建PKS5与AtJ3不同标签蛋白植物表达载体，共转入拟南芥野生型(Col-0)原生质体中。Co-IP试验表明：在植物体内，PKS5与AtJ3也存在相互作用(图4:B)。在原生质体与植物中表达AtJ3绿色荧光与PKS5黄色荧光融合蛋白，使用Confocal观察两者的亚细胞定位，图4C表明AtJ3与PKS5在细胞膜、细胞质与细胞核中均有表达。PKS5与AtJ3表达在细胞中有重叠。此支持AtJ3与PKS5在酵母与原生质体中相互作用结果。上述结果说明体内PKS5与AtJ3存在相互作用，共同参与特定的信号过程。

2.5 atj3-1与atj3-2萌发期ABA表型

AtJ3与PKS5体内存在相互作用。pks5-3和pks5-4表现对ABA的敏感表型。为测试AtJ3是否也参与了植物ABA响应过程，使用atj3-1与atj3-2功能缺失突变体(图5:A)对其ABA表型进行考察。结果表明：atj3-1与atj3-2在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上也显示对ABA的敏感表型(图5:B～C)。在0.3 μmol·L-1ABA处理下，与野生型相比较，atj3-1与atj3-2的萌发率降低(图5:B)。萌发后9 d，atj3-1与atj3-2的幼苗生长矮小，黄化程度增加(图5:C)，呈现与pks5-3和pks5-4在相同浓度ABA下的相似表型。atj3-1与atj3-2杂交F1子代与其亲代ABA表型相同，表明AtJ3的确参与了ABA响应过程。atj3-1与atj3-2在不同ABA浓度下的萌发率曲线表明，atj3-1与atj3-2的萌发率随ABA浓度的增加而下降(图5:D)，在0.15～0.75 μmol·L-1ABA浓度区间内，atj3-1与atj3-2在相同ABA浓度下的萌发率无显著差异(P<0.05)。

2.6 AtJ3与PKS5双突变体ABA表型

为确认AtJ3是否在遗传上与PKS5相互作用，共同参与植物ABA响应过程。将atj3-1与PKS5不同类型突变体进行杂交，构建atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4双突变体，并对其ABA表型进行考察，表型测试结果如图6所示。

在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上，atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4双突变体对ABA处理的表型一致，均表现为对ABA的敏感表型。生长12 d的幼苗出现生长矮小，atj3-1pks5-3出现严重黄化。双突变体与杂交亲本ABA的表型相比较，atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4对ABA的反应比各自的亲本更加强烈(图6:B-C)。而atj3-1pks5-1双突变体对ABA表型与atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4不同。atj3-1pks5-1与其单突变体对ABA的敏感性较atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4对各自单突变体的ABA降低(图6:A)。体外激酶活性测试表明，PKS5-3与PKS5-4较野生型PKS5有着更高的磷酸化活性(图2)。pks5-3和pks5-4为功能获得性突变体，pks5-1则为功能缺失突变体。此表明对于PKS5而言，其不同的突变形式对ABA的响应存在差异。不同类型PKS5突变体对ABA的响应与其体内激酶活性的差异相关。atj3-1与不同形式PKS5双突变体ABA表型与相应的PKS5突变体相似，表明AtJ3在遗传上处于PKS5的上游起作用。AtJ3与PKS5双突变体ABA表型分析也进一步说明，AtJ3与PKS5存在遗传上的相互作用，AtJ3处于PKS5的上游，在ABA同一信号途径起作用。

图5 atj3功能缺失突变体ABA表型 A. AtJ3功能缺失突变体鉴定；B. atj3-1与atj3-2功能缺失突变体在含0.3 μmol·L-1 ABA的MS平板上生长9 d后表现出ABA敏感表型；C. atj3-1与atj3-2杂交一代生长9 d后表现与亲代相似的ABA表型；D.不同ABA浓度下AtJ3突变体萌发率曲线Fig.5 atj3 knockout mutants were sensitive ABA A. Identification of two atj3 knockout mutants; B. atj3-1 and atj3-2 mutants showed ABA sensitive phenotype after 9 d growth on MS supplemented with 0.3 μmol·L-1 ABA; C. F1 generation of cross of atj3-1 and atj3-2 showed similar phenotype after 9 d growth as the parents; D. The germination curve of atj3 mutants under gradient ABA

图6 atj3-1pks5-1,atj3-1pks5-3与atj3-1pks5-4双突变体ABA表型 A.atj3-1pks5-1双突变体生长12 d的ABA表型；B.atj3-1pks5-3双突变体生长12 d的ABA的表型；C.atj3-1pks5-4双突变体生长12 d的ABA表型Fig.6 ABA phenotype of double mutants of atj3-1pks5-1, atj3-1pks5-3 and atj3-1pks5-4 A. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-1 after 12 d growth; B. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-3 after 12 d growth; C. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-4 after 12 d growth

2.7 AtJ3对PKS5激酶活性的影响

AtJ3与PKS5存在相互作用，共同参与拟南芥ABA响应，且AtJ3在遗传上处于PKS5上游起作用。为考察AtJ3与PKS5两者间在植物ABA响应中的分子作用机理，对AtJ3是否影响PKS5的激酶活性进行了测试。在体外PKS5激酶活性测试中加入重组AtJ3，测试PKS5激酶对通用底物MBP的磷酸化程度变化。图7A显示：当PKS5激酶活性测试体系加入AtJ3重组蛋白后，PKS5对MBP的磷酸化程度降低，表明AtJ3可抑制PKS5的激酶活性。随着体系中AtJ3含量的增加，PKS5的激酶活性下降。PKS5-3与PKS5-4的激酶活性较PKS5高，AtJ3对PKS5及其两种突变形式的激酶活性呈现相同的抑制模式，而AtJ3不能对与PKS5同源的SOS2激酶活性进行抑制，进一步说明AtJ3可对PKS5激酶活性以特异的抑制方式起作用。

图7 AtJ3抑制PKS5激酶活性 A.重组AtJ3体外抑制PKS5、PKS5-3和PKS5-4激酶活性(PKS5、PKS5-3与PKS5-4活性测定使用MBP为激酶作用底物；SOS2.对照，以P3为激酶作用底物；数字表示加入的不同量AtJ3蛋白；CBB.考马斯亮蓝染色；AUD.放射自显影；AUTO.PKS5蛋白激酶自磷酸化活性)；B.瞬时表达AtJ3的IP产物抑制PKS5激酶自磷酸化活性(RLS. Rubisco大亚基；supernatant.原生质体裂解上清液；Eluted fusion protein.洗脱的不同标签融合蛋白；Elution buffer.洗脱缓冲液；SCABP1.表达的SCABP1蛋白，作为阴性对照；CBB.考马斯亮蓝染色；AUTO.PKS5蛋白激酶自磷酸化活性)Fig.7 AtJ3 repressed PKS5 kinase activity A. Recombinant AtJ3 repressed the kinase activity of PKS5, PKS5-3 and PKS5-4 in vitro(Phosphorylation of PKS5,PKS5-3 and PKS5-4 were measured using MBP as substrate and SOS2 using P3 as substrate; SOS2 was used as control; Numbers indicate the amount of AtJ3 proteins added in assays; CBB. Coomassie blue stain；AUD. Autoradiograph；AUTO. PKS5 atuophosphorylation); B. IP product of transient expressed AtJ3 repressed PKS5 kinase attophosphorylation activity(RLS. Rubisco large subunit；supernatant. Protoplasts lysate superantant；Eluted fusion protein. Eluted FLAG-tagged fusion protein；SCABP1. SCABP1 protein used as negative control；CBB. Coomassie blue stain; AUD. Autoradiograph; AUTO. Aotopholpyorylation

为确认体内AtJ3对PKS5激酶活性的抑制作用，构建AtJ3及SCABP1的FLAG标签融合植物表达载体，转化拟南芥野生型(Col-0)原生质体进行FLAG融合蛋白表达。使用IP方法从原生质体中纯化植物表达AtJ3与SCABP1蛋白(图7：B上部)，将其加入体外PKS5激酶活性测试体系中进行PKS5激酶活性测试。结果表明：植物表达AtJ3对PKS5激酶活性同样具有抑制作用(图7：B下部)，与重组AtJ3对PKS5活性抑制作用相同。植物表达阴性对照SCABP1不能抑制PKS5激酶活性，说明植物表达AtJ3同样对PKS5活性抑制作用具有特异性。重组与植物表达AtJ3均对PKS5激酶活性具有抑制作用，表明在植物对ABA响应中，AtJ3通过对PKS5激酶活性的抑制方式参与ABA信号途径。

3 讨论

ABA参与植物发育过程及对外界各种环境胁迫，现已鉴定了多种参与ABA信号途径的元件。其中之一为蛋白激酶。PKSes属于CDPK-SnRK超家族中SnRK3亚家族。已发现PKS家族PKS3、PKS12、PKS18及PKS24为植物ABA信号途径中的成员，参与ABA响应过程。猜测PKS5也可能参与ABA响应过程。

为验证PKS5是否也参与ABA的响应过程，本研究使用PKS5不同类型突变体测试其在萌发期ABA处理下的表型。结果显示：在0.3 μmol·L-1ABA处理下，PKS5功能获得性突变体pks5-3与pks5-4在萌发期生长表现出对ABA的敏感表型。突变体萌发率下降，萌发后幼苗生长矮小，表现黄化现象。此说明PKS5在植物萌发与幼苗期参与植物的ABA响应过程。为获得与PKS5可能相互作用并参与ABA信号途径的元件，使用酵母双杂交技术，从拟南芥表达库中筛选到编码类似DnaJ热激蛋白的分子伴侣AtJ3，并对其两个功能缺失突变体atj3-1与atj3-2在萌发与幼苗期ABA表型进行了测试。atj3-1与atj3-2在萌发与幼苗期的ABA表型与PKS5突变体相似，也具有对ABA的敏感表型。对PKS5与AtJ3的杂交子代纯合双突变体的ABA表型测试表明：PKS5与AtJ3存在遗传上的相互作用，AtJ3处于PKS5上游起作用，共同参与对外源ABA处理的响应过程。结合体外PKS5与AtJ3相互作用证据，可确认PKS5与AtJ3在植物体内的确存在相互作用，二者共同参与ABA响应过程。重组与植物表达AtJ3均对PKS5的激酶活性具有抑制作用，表明在植物体内AtJ3以对PKS5激酶活性抑制的方式参与对PKS5的调节，响应外界ABA信号。本研究结果为ABA信号转导途径鉴定了新的参与元件，并提供了元件间的相互作用证据与分子作用机理。

在PKS5不同类型突变体对ABA处理的表型测试中，功能缺失突变体pks5-1与pks5-1atj3-1双突变体对ABA处理的敏感性低于其它类型的突变体。pks5-3、pks5-4及atj3-1pks5-3、atj3-1pks5-4则表现出萌发与幼苗期的ABA超敏感表型，其中pks5-3较pks5-4的ABA表型更为明显。pks5-3与pks5-4为功能获得性突变体，而pks5-1为功能缺失突变体，推测植物体内还存在处于PKS5下游的其它参与ABA基因调节的元件，当PKS5蛋白缺失时，未知对下游ABA元件的调节作用互补了PKS5的功能，只有当PKS5蛋白存在且其激酶活性发生变化时，PKS5对下游ABA元件的调节功能主要由PKS5承担，参与ABA的响应过程。

已有研究表明：PKS3与SCaBP5相互作用并在拟南芥ABA响应中起作用[30]。SCaBP1具有感应细胞内钙离子水平功能，作为钙的感应器可与PKS家族成员相互作用，激活与招募PKS家族成员至质膜上，最终激活目标调节子[31～34]。本研究确认AtJ3与PKS5相互作用并参与ABA信号过程，推测也同样存在SCaBP家族成员与PKS5相互作用共同参与ABA的响应过程。此外，已有报道表明：AtJ3与PKS5可对质膜质子泵进行调节，参与植物对外界高盐与pH响应过程[25]。由此，保持细胞内pH内平衡是否与ABA响应过程相关，AtJ3与PKS5是否在不同信号途径中具有交叉作用是本研究的进一步工作。

4 结论

研究使用拟南芥PKS5不同类型突变体确认PKS5蛋白激酶参与植物ABA响应，其为植物ABA信号转导途径中作用元件之一。此外，以PKS5为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术筛选到与PKS5相互作用的蛋白分子伴侣AtJ3。对2个拟南芥AtJ3功能缺失突变体的研究表明：AtJ3也参与植物ABA响应过程。对AtJ3与PKS5的遗传与生化测试表明：AtJ3与PKS5在体内存在着相互作用，AtJ3通过对PKS5蛋白激酶活性的抑制作用方式共同参与植物ABA响应过程。

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AtJ3isInvolvedinABAResponsethroughInteractionwiththePKS5KinaseinArabidopsis

ZHAO Fei-Yi JIAO Cheng-Jin CHEN Quan JIA Zhen WANG Tai-Shu ZHOU Hui

(School of Bioengineering & Biotechnology,Tianshui Normal University,Tianshui 741000)

The phytohormone abscisic acid(ABA) has a wide range of important roles in plant growth and development as well as abiotic stress response. Previous studies identified the enormous components involved in ABA responses in plants. We identified a chaperon AtJ3(Arabidopsis thaliana DnaJ homolog 3; heat shock protein 40-like) using yeast two-hybrid assays in which PKS5 was used as bait. TheAtJ3 T-DNA mutantsatj3-1 andatj3-2 displayed ABA phenotypes. Seed germinations ofatj3-1 andatj3-2 decreased, and the seedlings of them showed stunted growth and leaf chlorotic symptoms under ABA. Double mutants ofatj3-1pks5-1,atj3-1pks5-3 andatj3-1pks5-4 had similar ABA phenotypes as mutants ofAtJ3 orPKS5. Moreover, the assays of subcellular location and transgenic plants showed that AtJ3 has overlapping expression pattern with PKS5. By co-immunoprecipitation andinvitrophosphorylation, AtJ3 physically interacts with PKS5 and represses the PKS5 kinase activity. Therefore, AtJ3 interacts with PKS5 in response to ABA by repressing the PKS5 kinase activity.

ABA response；AtJ3；interaction；phosphorylation repress； PKS5

国家自然科学基金(31260568和31160060)

赵菲佚(1972—)，男，副教授，博士，主要从事植物分子生物学研究。

2015-07-17

Q789

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.015