酶联免疫吸附法检测水产品中的氟苯尼考

2016-11-10陈成良梁淑婷周丽容

现代食品 2016年7期

◎陈成良，黄湖，梁淑婷，周丽容

（1.深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东深圳 518052；2.东莞市国康检测技术有限公司，广东东莞 523071；3.广州恩康生物科技有限公司，广东广州 510663）

酶联免疫吸附法检测水产品中的氟苯尼考

◎陈成良1，黄湖2，梁淑婷2，周丽容3

氯霉素被禁用于动物性食品后，作为氯霉素类药物的氟苯尼考，在畜牧业中得到广泛应用，对畜禽疾病的控制和治疗起到了重要的作用。随着研究的深入，发现氟苯尼考也有许多毒副作用。因此，必须控制氟苯尼考在动物性食品中的残留，以保障消费者的健康。酶联免疫检测法（ELISA）是一种简便、快速、并适合大规模样品筛选的检测方法。本实验运用ELISA方法检测肉类中残留的氟苯尼考含量，并得到该方法检测的灵敏度、检测下限、交叉反应率、结果重现率等数据，之后用LC-MS对ELISA实验数据进行方法确认。发现运用ELISA检测鱼、虾、肉类中氟苯尼考残留的检测限可低至0.1 μ g/L，回收率可达70%～120%，重复性好，且实验数据与LC-MS的数据相关性达到99.98%，这表明ELISA是一种检测鱼、虾、肉类食品中氟苯尼考残留的可靠方便的方法。

氟苯尼考；酶联免疫吸附法；检测

酶联免疫吸附（ ELISA）是一种检测大分子抗原和特异性抗体的方法。该方法将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面发生反应［1，2］，由于酶的高效催化可放大反应，使得该检测方法能达到极高的灵敏度，该方法也被广泛应用于氯霉素、莱克多巴胺等抗生素或食品添加剂残留的检测［3］。ELISA常用类型主要包括间接法测抗体、双抗体夹心法测抗原［4］以及竞争法测抗原［5］。

氟苯尼考又称氟代甲砜霉素，是与氯霉素活性相似的广谱抗生素，对绝大多数革兰氏阴性和阳性水产病原菌呈高度抗菌活性，具有高效、吸收快等特点，自面市以来得到广泛应用［6］。尤其是在氯霉素、硝基呋喃类抗生素被禁用后，氟苯尼考在水产品养殖中得到更加广泛的使用。相对于氯霉素和甲砜霉素而言，氟苯尼考的毒性低、环境污染小、不易引起动物再生障碍性贫血，也不会致畸、致癌和致突变，但具有一定的免疫毒性和胚胎毒性［7］。此外，氟苯尼考的使用也会使得水体中抗生素累积，破坏生态环境，对水产品质量安全造成影响［8，9］。MaxSignalTM氟苯尼考酶联免疫反应试剂盒基于竞争性酶联免疫原理研制而成，可用于检测饲料、鱼、虾、鸡蛋、蜂蜜、肉类（牛肉、鸡肉、猪肉）、牛奶、奶粉、血清和尿液中氟苯尼考的残留。

MaxSignalTM氟苯尼考酶联免疫反应试剂盒为养殖者和政府监督管理部门提供了快速的检测技术。试剂盒操作简便、快速。其优点包括：高回收率（＞80%）；前处理方法效果好；高灵敏度（0.15 ），低检出限（鱼、虾、肉类为0.1 μg/L）；快速检测，在不考虑样品数量的情况下只需不到2小时；高重现性。

1 实验原理

MaxSignaLTM氟苯尼考酶联免疫反应试剂盒基于竞争性酶联反应原理，相关的氟苯尼考抗体包被于微孔板上，样品和一抗结合物一并加入到微孔中。如果样品中存在氟苯尼考，则其将与一抗结合物竞争地与预包被的氟苯尼考抗原结合。此时加入二抗结合物，二抗结合物将与结合了一抗结合物的抗原进行结合，加入底物后，微孔显色，得到相应的OD值的大小与样品中氟苯尼考的含量成反比［10，11］。

本实验还使用液相质谱连用的方式对ELISA检测结果进行验证［12，13］。

2 实验结果

2.1 确定限（CCα，μg/L）

使用美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 试剂盒检测不同样品中氟苯尼考的确定限如表 1 所示，对肌肉/鱼类/虾中氟苯尼考检测的确定限可低至0.1 μg/L。

表1 不同样品中氟苯尼考的确定限表

*CCα：确定限，指等于和高于此值时，用α误差概率得出认为样品不符合规定结论的限度，CCα通过对加标样品进行检测得出。通过此方法，有50%的实验结果能根据CCα被检出。

2.2 检测容量（CCβ，μg/L）

使用美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 试剂盒检测不同样品中氟苯尼考的检测容量如表 2 所示。

表2 不同样品中氟苯尼考的检测容量表

2.3 回收率

使用美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 试剂盒检测不同样品中氟苯尼考的回收率如表 3 所示。

表3 不同样品中氟苯尼考的回收率表

平均回收率通过对每个不同种类的样品分别进行20次平行加标（以CCβ为加标量）实验得出。变异系数（CV）小于20%。（这里是表的注释）

2.4 特异性（交叉反应率）

使用美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 试剂盒检测各种与氟苯尼考同类的抗生素药物的灵敏度及交叉反应率如表 4 所示。

表4 各种同类抗生素药物的灵敏度及交叉反应率表

2.5 精密度和重现性

由表5可知标准品组内实验变异系数＜7%。

表5 标准品组内实验的变异系数表

变异系数CV=（S.D./μ）×100，S.D.为10次重复实验的标准偏差，μ为10次重复实验的平均值

2.6 标准曲线

如图1所示，标准品浓度与相对吸光值成反比关系。

图1 氟苯尼考标准曲线图

2.7 试剂盒抗体的重现性

不同浓度的标准品，用本ELISA试剂盒在进行10次的平行检测实验后，组内的变异系数均小于5%，说明试剂盒标准品的重现性好，见表6。

表6 试剂盒标准品的精密度表

2.8 方法确认

对鱼类/虾/肉类（牛/鸡/猪）分别进行氟苯尼考一定浓度的加标实验，加标后操作流程如下：

（1）用适当的均质器进行均质；

（2）取3 g均质后样品，加入6 mL乙酸乙酯，最大速度漩涡振荡3 min；

（3）室温下4000 r/min离心5 min；

（4）移取4 mL上清液（含2 g待测样品）到另一试管中，60～70℃旋转蒸发或氮气吹干；

（5）加入2 mL正己烷溶解；

（6）加入1 mL 1×样品提取液，最大速度漩涡振荡2 min；

（7）室温下4000 r/min离心10 min，去掉上层正己烷层；

（8）移取50 μL下清液即可用于检测。若出现乳化现象，去掉上层正己烷层后，将下层清液 80～95 ℃水浴3 min后即可用于ELISA检测（样品同样可用于进行LC-MS确认）。

注：稀释倍数为0.5。

使用ELISA试剂盒和LC-MS同时对样品进行检测，结果见表7。

表7 ELISA试剂盒与LC-MS检测结果对照表

（1）假阴性：当LC-MS检测结果＞1 ppb，ELISA检测结果＜1 ppb，即为假阴性；

（2）假阳性：当LC-MS检测结果＜1 ppb，ELISA检测结果＞1 ppb，即为假阳性；

3 结论

对肉类进行加标实验的结果表明：美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA检测方法能灵敏地检测到样品低至0.1 ppb的氟苯尼考。另外该检测方法还拥有以下优点；高回收率（70%～120%）；高重复性；96孔高通量定量检测；使用快速的提取方法缩短样品前处理的时间和成本。更为重要的是，美国柏尔MaxSignalTM氟苯尼考ELISA检测方法与LC-MS检测方法的相关性非常好，相关系数达到99.98%。以上结果表明，美国柏尔公司的MaxSignalTM氟苯尼考ELISA检测试剂盒给政府部门、水产加工行业、质量监督管理部门提供了一种简单、快速、准确、高效、低成本的检测方法。

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The Inspection of Florfenicol in Aquatic Products by ELISA

Chen Chengliang1， Huang Hu2， Liang Shuting2， Zhou Lirong3
（1.Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center， Shenzhen 518052， China；2.Dongguan Guokang Detection Technology Co.， Ltd， Dongguan 523071， China；3.Guangzhou Ancon Biotechnology Co.， Ltd， Guangzhou 510663， China）

As a kind of chloramphenicol drug， f lorfenicol has been widely applied in animal husbandry after chloramphenicol was forbidden using in animal foods， which is playing significant role in control and therapy of diseases in livestock and poultry. With deep research， the using of florfenicol was also found causing a lot of toxic side effects. Therefore， the quantity of residual florfenicol in animal foods should be taken in control so as to guarantee consumers' health. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） is a simple， quick inspection method which is terribly suitable for large scale sample screening. The paper inspected the residual florfenicol in meat by means of ELISA， as well as obtained the data on sensitivity， detect limit， spec ificity and replication percentage of the means. Then， LC-MS was used to validate the dependability of ELISA. The detection limit of f lorfenicol in meat can be as low as 0.1 μg/L by the means of ELISA， the recovery rates was up to 70%～120%， and the relevance between LC-MS and ELISA up to 99.98%， all the data shows that ELISA is a dependable and convenient methods to inspect the residual florfenicol in meat.

Florfenicol； Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）； Inspection