氢饱和生理盐水对大鼠APALI的保护作用

2016-11-10冷波薛钰婷李波

现代医药卫生 2016年18期

冷波，薛钰婷，李波

（1.西南医科大学附属中医医院普外科，四川泸州646000；2.西南医科大学附属医院重症医学科，四川泸州646000；3.西南医科大学附属医院肝胆外科，四川泸州646000）

冷波1，薛钰婷2，李波3△

目的探讨经尾静脉注射氢饱和生理盐水对牛磺胆酸钠诱导的大鼠重症急性胰腺炎相关性肺损伤（APALI）的保护作用。方法（1）大鼠重症APALI模型的建立及处理：将54只健康SD雄性大鼠随机分为假手术组（Sham组）、模型组［重症急性胰腺炎（SAP）+氯化钠注射液（NS）组］和氢水处理组（SAP+H2组），每组18只；各组再按6、12、24 h 3个时间点分为三组，每组6只。Sham组大鼠开腹翻动胰腺数次后随即关腹，不作其他处理，SAP+NS、SAP+H2组以5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）经胆胰管开口逆行注入（0.1 mL/min）建立模型，在建模成功后1 h经尾静脉分别注射5 mL/kg生理盐水或等量氢饱和生理盐水。（2）各组分别在6、12、24 h 3个时间点处死大鼠，收集血清，用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测血清TNF-α、IL-1β水平。结果（1）SAP+NS、SAP+H2组血清中TNF-α水平在6、12、24 h各个时间点［SAP+NS组：（215.3± 6.0）、（263.2±7.4）、（288.0±5.6）ρg/mL，SAP+H2组：（204.1±8.5）、（122.4±10.3）、（84.1±8.6）ρg/mL］均高于Sham组［（58.8± 7.5）、（57.5±5.1）、（59.6±6.0）ρg/mL］，且SAP+NS组在3个时间点的TNF-α水平均高于SAP+H2组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）SAP+NS、SAP+H2组血清中IL-1β水平在6、12、24 h各个时间点［SAP+NS组：（152.8±9.8）、（215.4±10.4）、（254.3±8.6）ρg/mL，SAP+H2组：（154.7±6.8）、（80.3±8.3）、（59.3±8.2）ρg/mL］均高于Sham组［（39.8±3.3）、（39.5±3.3）、（40.5± 5.2）ρg/mL］，且SAP+NS组在12、24 h时IL-1β水平均高于SAP+H2组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而SAP+H2组6 h的IL-1β水平与SAP+NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论经尾静脉注射氢饱和生理盐水对APALI有一定治疗保护作用。

氢；氯化钠；胰腺炎，急性坏死性/并发症；肺/损伤；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β；大鼠

重症急性胰腺炎（severe acute pancreastitis，SAP）在临床上发展快、病死率高，尤其是急性胰腺炎相关性肺损伤（acute pancreatitis associated lung injury，APALI）［1］是SAP最常见和最严重的并发症之一，是SAP早期主要死亡原因。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的成员之一，在应激因素如细胞炎症因子（TNF-α、IL-1）、生长因子等刺激下激活。有研究表明，在SAP早期，肺组织中JNK信号通路已被激活，从而使活化蛋白-1（acti-vating protein 1，AP-1）激活，活化的AP-1可上调IL-1β、TNF-α的表达，在APALI中起重要作用［2］。同时，已有研究证实，在SAP发病早期氧化应激已发生，大量的氧自由基可影响细胞内外信号转导通路［3］。因此，抗氧化应激治疗可能是减轻SAP病情发展、治疗APALI的重要手段。

2007年日本学者Ohsawa等［4］发现，氢气具有选择性抗氧化作用。这一研究结果迅速引起众多学者的广泛关注，从而掀起了氢分子医学的研究热潮［5-6］。近年来研究发现，氢分子具有减轻炎症、抗肺纤维化、保护肺泡免受氧化损伤的作用［7-9］。本实验研究拟在建立大鼠SAP模型的基础上，探讨经尾静脉注射氢饱和生理盐水是否对SAP及APALI具有保护作用，旨在为SAP及APALI的抗氧化应激治疗提供新方向。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康成年雄性SD大鼠54只，清洁级，体质量250～300 g，购于西南医科大学（原泸州医学院）实验动物饲养中心。

1.1.2主要实验试剂氢饱和生理盐水，大鼠IL-lβ试剂盒、大鼠TNF-α试剂盒均购自德国Bender公司。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组将54只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组）、模型组［SAP+氯化钠注射液（NS）组］及氢水处理组（SAP+H2组），每组18只。各组再按6、12、24 h 3个时间点分为3个小组，每组6只。

1.2.2实验动物模型的建立所有大鼠在实验前12 h禁食不禁饮%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔内注射麻醉，麻醉显效后，常规消毒、铺巾。取上腹正中切口入腹，暴露胰腺及十二指肠。SAP+NS、SAP+H2组在大鼠近肝门处寻找到胆总管，用动脉夹进行夹闭，用4号半头皮针经十二指肠壁、十二指肠乳头穿刺入胆胰管约0.5cm，缓慢注入（0.1mL/min）5%无菌牛磺胆酸钠（1 mL/kg）；用动脉夹夹闭靠近十二指肠乳头的胆胰管远端，5 min后可见胰腺肿胀、充血，去除动脉夹使胆胰管复通，用纱布压迫穿刺孔，查无胆漏后关腹。Sham组大鼠开腹后翻动十二指肠并触摸胰腺数次，随即关腹，不做其他处理。SAP+NS、SAP+H2组在大鼠SAP模型建模成功后1 h分别经尾静脉注射5 mL/kg生理盐水或等量氢饱和生理盐水。

1.2.3血液样本每组大鼠在麻醉显效后，心脏采血3～4 mL，12 000 r/min低温高速离心得血清1.5～2.0 mL，-20℃保存备用。

1.2.4检测指标及方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定大鼠血清TNF-α、IL-1β水平，具体操作步骤如下。（1）标准品（试剂原液）的稀释：从4℃冰箱取出试剂盒，开启试剂盒之前在室温平衡30 min。取120 μL原倍标准品加入120 μL的标准品稀释液（1号），取120μL1号标准品加入120μL的标准品稀释液（2号），取120 μL 2号标准品加入120 μL的标准品稀释液（3号），取120 μL 3号标准品加入120μL的标准品稀释液（4号），取120 μL 4号标准品加入120 μL的标准品稀释液（5号）。（2）加样：具体操作过程见表1。盖上封板膜，振荡混匀，37℃温育60 min。（3）洗涤和显色：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，再每孔加满稀释的洗涤液（浓缩洗涤液∶蒸馏水为1∶19），静置30 s后弃去，重复5次，拍干。再依次加入显色剂A 50 μL和显色剂B 50 μL，振荡混匀，37℃避光显色10 min。（4）终止和测定：每孔加终止液50 μL，终止反应。在加终止液后10 min内，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。（5）计算：以标准品浓度及对应OD值作标准曲线并计算直线回归方程，再以样品OD值代入回归方程计算对应的样品浓度。

表1　加样具体操作过程

1.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，多样本比较采用方差分析；变量相关性采用Pearson相关分析，取双侧a=0.05为标准。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠不同时间点血清中TNF-α水平比较SAP+NS、SAP+H2组大鼠血清中TNF-α水平在6、12、24 h 3个时间点均高于Sham组，且SAP+NS组各时间点TNF-α水平均高于SAP+H2组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。TNF-α水平标准曲线见图1。

2.2各组大鼠不同时间点血清中IL-1β水平比较SAP+NS、SAP+H2组大鼠血清中IL-1β水平在6、12、24 h 3个时间点均高于Sham组，且SAP+NS组在12、24 h时IL-1β水平均高于SAP+H2组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；虽然SAP+H2组在6 h时IL-1β水平高于SAP+NS组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。IL-1β水平标准曲线见图2。

表2　各组大鼠不同时间点血清中TNF-α水平比较（，ρg/mL）

注：与Sham组同一时间点比较，aP＜0.05，与SAP+NS组同一时间点比较，bP＜0.05。

Sham组SAP+NS组SAP+H2组24 h 59.6±6.0 288.0±5.6a84.1±8.6ab6 6 6 6 h 58.8±7.5 215.3±6.0a204.1±8.5ab12 h 57.5±5.1 263.2±7.4a122.4±10.3ab

图1　TNF-α水平标准曲线

表3　各组大鼠不同时间点血清中IL-1β水平比较（，ρg/mL）

注：与Sham组同一时间点比较，aP＜0.05；与SAP+NS组同一时间点比较，bP＜0.05。

组别Sham组SAP+NS组SAP+H2组24 h 40.5±5.2 254.3±8.6a59.3±8.2abn 6 6 6 6 h 39.8±3.3 152.8±9.8a154.7±6.8a12 h 39.5±3.3 215.4±10.4a80.3±8.3ab

图2　IL-1β水平标准曲线

3　讨论

APALI在并发症中的发生率高达60%～70%，其中继发急性呼吸窘迫综合征占20%，为SAP早期的主要死亡原因［10］。有研究报道，SAP激活了全身炎症连锁反应［11］。实验证明，氧化应激反应在APALI早期已发生，其产生的氧自由基可通过调控蛋白细胞信号通路致炎症因子增加，加重肺组织损伤，在APALI中发挥重要作用［12-13］。因此，抗氧化应激可能是改善APALI的一种途径。

基于前面的研究，本实验在建立大鼠APALI模型的基础上，经尾静脉注射氢饱和生理盐水观察其治疗效果。结果显示，SAP+H2组大鼠在6、12、24 h时血清中TNF-α水平均低于SAP+NS组，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明氢饱和生理盐水对TNF-α炎症因子有明显抑制作用；SAP+H2组在6 h时血清中IL-1β水平与SAP+NS组比较无明显差异，而随着时间的变化，在12、24 h时均低于SAP+NS组，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明氢饱和生理盐水对IL-1β炎症因子有抑制作用。

综上所述，本实验通过向APALI大鼠模型尾静脉注射氢饱和生理盐水后观察到血清中TNF-α、IL-1β水平有所抑制。因此，作者认为，氢饱和生理盐水可能通过其选择性抗氧化应激作用，从而下调TNF-α、IL-1β的表达，对APALI起到一定的治疗保护作用。但是，实验中也观察到在SAP早期（6 h以内）SAP+H2组与SAP+NS组血清中IL-1β水平无明显差异，这些问题有可能是后续实验研究的另一方向。

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Protective effect of hydrogen saturated saline on severe acute pancreatitis associated lung injury in rats

Leng Bo1，Xue Yuting2，Li Bo3△
（1.Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；2.Department of Intensive Care Medicine，Affiliated Hospital，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；3.Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of intravenous hydrogen saturated saline on sodium taurocholate induced rat severe acute pancreatitis associated lung injury（APALI）.Methods（1）The establishment and treatment of severe APALI model：54 healthy male SD rats were randomly divided into the sham operation group（Sham group），model group［severe acute pancreatitis（SAP）+normal saline（NS）group］and hydrogen water treatment group（SAP+H2group），18 cases in each group；each group was subdivided into 3 subgroups according to the time points of 6，12，24 h，6 cases in each subgroup.In the Sham group，the pancreas was stirred for several times after laparotomy and then the abdominal cavity was closed without conducting other treatment.In the SAP+NS group and SAP+H2group，5%sodium taurocholate（1 mL/kg）was retrogradely injected by the biliarypancreatic duct opening（0.1 mL/min）for constructing the model，5 mL/kg normal saline or the equivalent hydrogen saturated saline was respectively injected by the tail vein at 1 h after successfully constructing the model.（2）Rats in each group were killed for collecting serum at the time points of 6，12，24 h.The serum TNF-α and IL-1β levels were detected by ELISA.Results（1）The TNF-α levels at 6，12，24 h were（215.3±6.0），（263.2±7.4），（288.0±5.6）ρg/mL in the SAP+NS group and（204.1±8.5），（122.4±10.3），（84.1±8.6）ρg/mL in the SAP+H2group，which were higher than（58.8±7.5），（57.5±5.1），（59.6±6.0）ρg/mL in the Sham group，moreover the TNF-α level at 3 time points in the SAP+NS were higher than those in the SAP+H2group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.（2）The IL-1β levels at 6，12，24 h were（152.8±9.8），（215.4±10.4），（254.3±8.6）ρg/mL in the SAP+NS group and（154.7±6.8），（80.3±8.3），（59.3±8.2）ρg/mL in the SAP+H2group，which were higher than（39.8±3.3），（39.5± 3.3），（40.5±5.2）ρg/mL in the Sham group，moreover which at 12，24 h in SAP+NS group were higher than those in the SAP+H2group，the differences were statistically significant（P＜0.05），while the IL-1β level at 6 h had no statistical difference between the SAP+H2group and SAP+NS group（P＞0.05）.ConclusionThe tail vein injection of hydrogen saturated saline has certain treatment and protective effect on APALI.

Hydrogen；Sodium chloride；Pancreatitis，acute necrotizing/complications；Lung/injuries；Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-1beta；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.007

1009-5519（2016）18-2803-03

冷波（1984-），硕士研究生，主要从事普外科临床工作。

△，E-mail：Liboer2002@126.com。

（2016-04-30）