硫酸右旋糖苷对人胃癌细胞腹腔种植转移防治作用的对比研究*

王娟，黄允宁，颜贝，王红红，金秀，王潇飞，徐远义△

（1.宁夏医科大学病理学系，宁夏银川750004；2.宁夏回族自治区人民医院，银川750002；3.宁夏医科大学总医院精子库，宁夏银川750001）

硫酸右旋糖苷对人胃癌细胞腹腔种植转移防治作用的对比研究*

王娟1，黄允宁2，颜贝3，王红红2，金秀1，王潇飞1，徐远义1△

（1.宁夏医科大学病理学系，宁夏银川750004；2.宁夏回族自治区人民医院，银川750002；3.宁夏医科大学总医院精子库，宁夏银川750001）

目的探讨预防性使用硫酸右旋糖苷（DS）和治疗性使用DS对人胃癌细胞腹腔种植的作用。方法培养胃癌BGC-823细胞，构建裸鼠动物模型：选用BALB/C裸鼠共110只，随机分为预防组（60只）和治疗组（50只）。预防组在注射肿瘤细胞的同时注射DS，治疗组注射肿瘤细胞24 h后注射DS。打开裸鼠腹腔，观察胃癌细胞腹腔种植的数量，所有结节经HE染色证实。应用免疫组织化学染色（SP法）检测大网膜整合素β1蛋白的表达，应用RT-PCR方法检测大网膜整合素β1 mRNA的表达。结果HE染色结果显示治疗组裸鼠腹腔转移的肿瘤结节数量明显多于预防组，差异有统计学意义（P＜0.05），SP法结果显示治疗组整合素β1蛋白的表达量明显高于预防组，差异有统计学意义（P＜0.01），RT-PCR结果显示治疗组整合素β1 mRNA的表达量明显高于预防组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论DS预防胃癌腹腔种植转移的效果比治疗胃癌腹腔种植转移的效果更佳。

硫酸类；右旋糖酐类；胃肿瘤/病理学；腹腔；抗原，CD29；整合素β1；种植

肿瘤腹腔种植转移是一个多因素、连续性、多个不同阶段参与的复杂过程。肿瘤细胞黏附到腹膜上是肿瘤细胞腹腔种植转移的基本步骤之一，是由多种因素决定的。有研究表明，肿瘤的浸润及转移与其黏附分子表达的改变有关［1］。整合素是黏附因子家族中的一员，其表达异常与肿瘤细胞腹腔种植转移关系密切［2］。整合素是α、β亚基以非共价键形成的异二聚体［3］，以整合素β1的作用最为突出，其通过胞外区与多种细胞外基质黏附，参与细胞之间及细胞与细胞外基质之间的黏附，其胞内区也可通过与细胞骨架和多种信号分子结合形成黏附物进行信号转导［4-5］，肿瘤的发生和转移与整合素β1的表达量有密切关系。

Hagiwara等［6］研究及本课题组前期研究［7］结果表明，硫酸右旋糖苷（DS）可以通过抑制整合素β1的表达抑制胃癌细胞的腹腔种植转移。本研究拟进一步探讨使用DS对整合素β1的表达及胃癌腹腔种植转移的预防和治疗是否有差别。现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞选用北京金紫晶公司肿瘤细胞库培育的人胃癌BGC-823细胞株，储存于液氮中，经复苏接种于10%灭活小牛血清RPMI-1640完全培养基中，在温度37℃、湿度70%、5%CO2条件下培养。

1.1.2实验动物选用购自北京维通利华公司的BALB/c裸鼠为实验对象，动物许可证号：SCXX（京）2006-0009，均为雄性，5～6周龄，体质量18～22 g。裸鼠可自由摄入无菌食物和水。

1.1.3药品与试剂大分子DS购自美国Sigma公司，用0.9%NaCl溶液稀释后，再利用22 μm过滤器过滤，最终配制成0.3%DS溶液。浓缩型CD34兔抗多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗鼠VEGF兔抗多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司，兔抗羊二抗即用型抗体购自北京中杉金桥公司，PCR试剂盒购自日本Takara公司，Total RNA Kit购自OmegaBio-Tek公司，RT reagentKit购自美国Frementas公司。

1.2方法人胃癌细胞株腹腔种植裸鼠模型的制备：将110只BALB/c裸鼠采用随机数字表法分为预防组（60只）和治疗组（50只）。所有裸鼠在造模前进行麻醉：将戊巴比妥钠粉末用0.9%NaCl溶液配制成0.5%戊巴比妥溶液，采用50 mg/kg的剂量麻醉裸鼠，将所有裸鼠腹部皮肤和腹中线常规消毒，选择左侧正中旁切口，长为0.8cm，暴露胃壁，将浓度为每毫升1×107个的BGC-823胃癌细胞悬浮液悬空滴入裸鼠胃壁（每只0.2 mL），使胃癌细胞悬浮液延胃壁表面流入胃壁附近的腹腔并关腹，立即向预防组裸鼠腹腔中注射0.3%DS（每只1 mL）；治疗组裸鼠于注射癌细胞24 h后向裸鼠的腹腔中注射0.3%DS（每只1 mL）。整个造模过程中严格遵循无菌操作。预防组分别在注射癌细胞后1、2、3、7、14 d处死裸鼠，并留一自然死亡组，根据这6个处死时间随机均分为6个小组，每组10只。治疗组分别在注射癌细胞的2、3、7、14 d处死裸鼠，并留一自然死亡组，根据5个处死时间随机均分为5个小组，每组10只。

1.2.1实验裸鼠的处理按时间点采用颈椎脱臼法处死裸鼠，取大网膜组织均分为2份，其中一份大网膜组织立即置于10%甲醛固定液中，用于HE染色、免疫组织化学染色（SP法）；另一份大网膜组织放入冻存管［预先消毒并用焦碳酸二乙酯溶液处理］中，在-80℃冰箱中储存，用作RT-PCR实验。

1.2.2HE染色及SP法将所取标本经如下步骤：10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色、SP法处理。整合素β1经SP法后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）代替一抗作阴性对照，以细胞膜及细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达标准。在IPP图像自动分析系统中，400倍镜下选定空白区作为测定标准，再选定具有代表性的5个视野，利用IPP图像自动分析系统对所选视野的平均光密度（optical density，OD）值进行计算，比较各组整合素β1的表达情况。

1.2.3RT-PCR利用Total RNA Kit试剂盒提取大网膜组织的总RNA，按试剂盒说明书进行操作，反转录合成cDNA。上海生工生物工程有限公司合成整合素β1引物，上游引物：5′-CGTAGCAAAGGAACAGCAGA-3′，下游引物：5′-GTAAGACAGGTCCATAAGGTAGTAG-3′，扩增片段长度为168 bp，反应条件：94℃4 min，94℃30 s，54.2℃30 s，72℃1 min，共30个循环，72℃7 min。磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物购自美国Fermatans公司，上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，扩增片段长度为496 bp，反应条件：94℃4 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共30个循环，72℃7 min。对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，再用溴化乙啶进行染色，采用美国Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照，记录染色结果，采集图像的扩增产物用Quantity One分析系统进行分析，基因表达丰度用相对光密度（relative optical density，ROD）代表，按整合素β1 ROD值/GAPDH ROD值计算各组的OD值。

1.3统计学处理应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，两样本比较采用t检验，多样本比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HE染色检测预防组和治疗组不同时间点腹腔种植的肿瘤结节数比较小鼠腹腔种植的肿瘤结节体积大小不一，质地略硬，表面较光滑，呈灰白色或瓷白色。界限清楚的肿瘤结节记为一个大结节，相互融合的记为一个独立结节，所有结节均经HE染色证实病理类型为胃癌转移结节。随着注射癌细胞时间的延长，预防组和治疗组腹腔种植的肿瘤结节数均逐渐增多，第14天、自然死亡时预防组小鼠腹腔种植的肿瘤结节数明显少于治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。且两组腹腔种植的肿瘤结节数比较，差异有统计学意义（F=2.296，P= 0.044）。见表1。

2.2SP法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1表达OD值比较预防组第2、3天及自然死亡时整合素β1表达OD值明显低于治疗组，差异有统计学意义（P＜0.01）。且两组整合素β1表达OD值比较，差异有统计学意义（F=243.890，P=0.000）。见图1、表2。

2.3RT-PCR法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1mRNA表达ROD值比较与治疗组比较，预防组第3、7、14天整合素β1 mRNA表达ROD值明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。且两组整合素β1 mRNA表达ROD值比较，差异有统计学意义（F=49.844，P=0.002）。见表3。

表1　HE染色检测预防组与治疗组不同时间点腹腔种植的肿瘤结节数比较（，个）

表1　HE染色检测预防组与治疗组不同时间点腹腔种植的肿瘤结节数比较（，个）

注：-表示无此项。

组别预防组治疗组t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡时FP 0.00±0.002.2960.044 ---0.00±0.00 0.33±0.52 -1.581 0.175 0.67±0.82 1.67±2.34 -0.989 0.346 4.60±3.20 6.83±3.55 -1.146 0.279 10.50±3.45 18.83±8.28 -2.244 0.049 41.83±3.75 58.00±2.90 -2.256 0.047 ----

表2　SP法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1表达OD值比较（）

表2　SP法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1表达OD值比较（）

注：-表示无此项。

组别预防组治疗组t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡时FP 35.75±0.95 ---9.90±1.34 14.87±0.41 -6.190 0.003 28.84±2.15 49.41±1.22 -14.403 0.000 50.85±0.82 53.56±2.53 -1.757 0.154 58.36±0.81 57.22±1.62 1.096 0.335 94.35±3.49 171.57±11.98 -10.723 0.000 243.8900.000 ----

表3　RT-PCR法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1 mRNA表达ROD值比较（）

表3　RT-PCR法检测预防组和治疗组不同时间点整合素β1 mRNA表达ROD值比较（）

注：-表示无此项。

组别预防组治疗组t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡时FP 1.05±0.0949.8440.002 ---1.22±0.11 1.60±0.27 -2.327 0.080 1.19±0.05 1.76±0.12 -7.410 0.002 1.56±0.10 2.44±0.10 -11.164 0.000 1.82±0.18 2.63±0.10 -6.652 0.003 2.22±0.08 2.15±0.17 0.652 0.550 ----

图1　SP法检测预防组和治疗组第3天整合素β1的表达（400×）

3　讨论

胃癌在全国和世界范围内都有很高的发病率和死亡率，随着近年来胃癌根治术的不断开展和成熟，胃癌的治疗和预后有了明显的改善，但由于胃癌的复发和转移使胃癌在各种恶性肿瘤中的病死率仍居于前列。胃癌术后的腹腔化疗是阻止胃癌腹腔种植转移的常规治疗手段。目前用于胃癌腹腔化疗的药物很多，但由于在腹腔吸收快，无法达到长期有效药物浓度等原因，治疗效果不是十分理想。本研究采用的DS是一种大分子右旋糖苷，相对分子质量大，约为50×104，在腹腔的吸收慢，使其能够在腹腔内长期维持有效的药物浓度。国外自1997年就有科研人员开始研究DS的抗癌作用。有研究已表明，DS可以阻止B-16黑色素瘤细胞在大网膜乳斑和腹膜上种植［8-9］，可以安全地用于胃肠吻合手术。

肿瘤的侵袭和转移是指肿瘤从原发部位脱离向周围和远处组织扩散形成另一同类型的肿瘤［1］，是一个多因素、多阶段的复杂过程。其基本步骤包括：癌细胞脱落进入腹腔形成具有生物活性的脱落癌细胞；脱落癌细胞在腹腔内游走并黏附于腹膜；癌细胞着床，增殖侵袭，最终发展成具有生物活性的转移癌结节。在这一过程中，细胞黏附是一个重要环节。有研究表明，无论体内还是体外实验均证实，整合素β1在胃癌细胞黏附固定于腹膜的过程中起着关键的作用［6，8］。Matsuoka等［10］在研究胃癌细胞株OCUM-2MD3附着于腹膜的过程中，发现整合素β1在具有腹膜转移特性的OCUM-2MD3细胞中表达量明显增高，且明显高于OCUM-2MD3（不具腹膜转移特性胃癌细胞株）的表达。可见整合素β1在肿瘤细胞离开肿瘤母体侵袭到腹膜的这一过程中，尤其在黏附过程中起着至关重要的作用。

本实验将小鼠开腹注入癌细胞后，预防组立即注射DS，在胃癌细胞发生腹腔种植之前DS就以一定的浓度存在，以此研究DS的预防作用，而治疗组是在癌细胞注射24 h后再注射DS，使胃癌细胞先于DS在腹腔中存在，以此研究DS的治疗作用。本课题组前期的实验结果已表明，DS可以减少胃癌细胞腹腔种植转移瘤的数量，并可能通过抑制整合素β1的表达抑制胃癌细胞的腹腔种植转移［11-12］。本研究中SP法和RT-PCR结果均显示，预防组整合素β1的表达明显低于治疗组，预防组癌细胞腹腔种植的数量也明显少于治疗组，差异均有统计学意义（P＜0.01），说明DS预防胃癌腹腔种植转移的效果明显优于治疗的效果。

本课题组前期对DS抑制胃癌腹腔种植的作用进行了深入研究，但对于DS何时应用效果更好还没有明确的支持依据。本研究通过比较预防组和治疗组胃癌细胞腹腔种植转移的肿瘤结节数和整合素β1的表达量，研究DS对胃癌腹腔种植转移预防和治疗效果的影响，结果显示，预防性使用DS使癌细胞一进入腹腔就处于DS的药物环境中比癌细胞注入24 h再治疗性使用DS的效果好。这一研究结果为DS的具体临床用药时间提供了依据，为临床胃癌腹腔种植转移的预防性用药提供了广阔的前景。

［1］Kawamura T，Endo Y，Yonemura Y，et al.Significance of integrin alpha2/ beta1 in peritoneal dissemination of a human gastric cancer xenograft model［J］.Int J Oncol，2001，18（4）：809-815.

［2］NiuG，ChenX.Whyintegrinasaprimarytargetforimaging and therapy［J］. Theranostics，2011，1：30-47.

［3］Longhurst CM，Jennings LK.Integrin-mediated signal transduction［J］. Cell Mol Life Sci，1998，54（6）：514-526.

［4］Gruber G，Hess J，Stiefel C，et al.Correlation between the tumoral expression of beta3-integrin and outcome in cervical cancer patients who had undergone radiotherapy［J］.Br J Cancer，2005，92（1）：41-46.

［5］Miranti CK，Brugge JS.Sensing the environment：a historical perspective on integrin signal transduction［J］.Nat Cell Biol，2002，4（4）：E83-90.

［6］Hagiwara A，Sawai K，Sakakura C，et al.Prevention of peritoneal metastasis of cancer with dextran sulfate——an experimental study in mice［J］.Anticancer Drugs，1997，8（9）：894-897.

［7］徐远义，黄允宁，王炜，等．硫酸右旋糖苷抑制人胃癌细胞粘附以及整合素β1基因表达的机制研究［J］．中国药理学通报，2007，23（12）：1552-1555．

［8］Hagiwara A，Sakakura C，Yamasaki J，et al.Dextran sulfate inhibits injured abdominal wall-specific tumor implantation in mice［J］.Anticancer Drugs，2000，11（10）：873-877.

［9］Chen X，Liu S，Hou Y，et al.MicroPET imaging of breast cancer alphavintegrin expression with 64Cu-labeled dimeric RGD peptides［J］.Mol Imaging Biol，2004，6（5）：350-359.

［10］Matsuoka T，Hirakawa K，Chung YS，et al.Adhesion polypeptides are useful for the prevention of peritoneal dissemination of gastric cancer［J］. Clin Exp Metastasis，1998，16（4）：381-388.

［11］王娟，赵雪艳，荣小伟，等．硫酸右旋糖苷对人胃癌细胞腹腔种植转移和整合素β1表达的影响［J］．诊断病理学杂志，2014，21（4）：224-227．

［12］王娟，赵雪艳，王红红，等．硫酸右旋糖苷对人胃癌细胞腹腔种植转移和VEGF表达的影响［J］．临床与实验病理学杂志，2014，30（6）：625-628．

Comparative study of prevention and treatment effect of dextran sulfate on human gastric cancer cells celiac planting metastasis*

Wang Juan1，Huang Yunning2，Yan Bei3，Wang Honghong2，Jin Xiu1，Wang Xiaofei1，Xu Yuanyi1△
（1.Department of Pathology，Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750004，China；2.Ningxia Hui Autonomous Region People′s Hospital，Yinchuan 750002，China；3.Sperm Bank，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750001，China）

ObjectiveTo study the effect of dextran sulfate（DS）between preventive use and treatment use on human gastric cancer cells celiac plantation.MethodsGastric cancer BGC-823 cells were cultured for constructing the nude mice model.One hundred and ten BALB/C nude mice were randomly divided into the prevention group（60 cases）and treatment group（50 cases）.The prevention group was simultaneously injected by tumor cells and DS，while the treatment group was injected with DS at 24 h after injecting tumor cells.The abdominal cavity of nude mice was opened for observing the celiac planting number of gastric cancer cells.The whole nodules were verified by the HE staining.The expression level of greater omentum integrin β1 protein was detected by immunohistochemistry and the expression of greater omentum integrin β1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsThe HE staining showed the number of intraperitoneal metastatic tumor nodules in the treatment group was significantly more than that of the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The immunohistochemical results showed that the expression of integrin β1 protein in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The RT-PCR results showed that the expression of integrin β1 mRNA in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionDS has better effect for preventing gastric cancer celiac implanting metastasis than for treating gastric cancer celiac implanting metastasis.

Sulfuric acids；Dextrans；Stomach neoplasms/pathology；Abdominal cavity；Antigens，CD29；Integrin beta 1；Plant

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.004

A

1009-5519（2016）18-2793-03

宁夏回族自治区科技厅科技支撑项目（2002310201）；宁夏医科大学校级课题项目（XM2015002）。

王娟（1987-），硕士研究生，从要从事肿瘤病理研究工作。

△，E-mail：nxxyy@hotmail.com。

（2016-04-15）