免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴细胞白血病实验研究

刘晓蕾，高磊，崔娜

（河北省保定市第一中心医院1.血液内科，2.彩超室，3.妇科，河北 保定 071000）

免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴细胞白血病实验研究

刘晓蕾1，高磊2，崔娜3

（河北省保定市第一中心医院1.血液内科，2.彩超室，3.妇科，河北 保定 071000）

目的探讨免疫毒素CCL25-PE38对急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系MOLT4（天然高水平表达CCR 9）的杀伤作用，以期为T-ALL的靶向治疗提供基础。方法通过流式细胞术、共聚焦显微术检测CCL25-PE38与MOLT4细胞的结合及内化，Transwell趋化小室检测其趋化能力，细胞增殖试剂WST-1检测其细胞杀伤能力，Annexin V-FITC/PI染色检测其凋亡诱导效应，建立SCID小鼠白血病细胞异种移植肿瘤（CCR 9+肿瘤）模型检测CCL25-PE38的抑瘤效果。结果WST-1检测结果显示CCL25-PE38能特异性杀伤MOLT4细胞；Annexin V-FITC/PI染色显示CCL25-PE38主要通过凋亡诱导效应引起MOLT4细胞死亡；在SCID小鼠白血病细胞异种移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能缓解CCR 9+肿瘤的生长。结论CCL25-PE38通过凋亡诱导作用引起MOLT4细胞死亡，缓解异种移植CCR 9+肿瘤的生长。

CCL25-PE38；急性T淋巴细胞白血病；免疫毒素

白血病在全球发病率呈上升趋势，我国白血病发病率为十万分之三，每年约新增40 000例患者。白血病表现为骨髓造血组织恶性增生，形成大量异常的白细胞，广泛浸润组织器官，引起多种组织器官不可逆损害，直接威胁患者生命。白血病的转移、复发与白血病细胞及其生长微环境相互作用密切相关。免疫毒素是一种由抗体或细胞因子与化学毒素耦合组成的融合蛋白。通过受体介导的内吞作用和随后的毒素成分被转运到细胞质，并与二磷酸腺苷结合，核糖基化延伸因子2（EF-2），从而导致蛋白质合成被抑制和靶细胞死亡[1]。PE38，38 kD的截短型绿脓杆菌外毒素A的衍生物，已被广泛作为免疫毒素毒素组分。例如，抗CD22的重组免疫毒素BL22，基于PE38的作用治疗毛细胞白血病证明是成功的[2]。重组免疫毒素8H9-PE38用于乳腺癌，骨肉瘤，神经母细胞瘤的治疗[3]。因此，重组免疫毒素可能是一种用于治疗癌症患者，尤其是血液肿瘤患者有前途的方法。以趋化因子受体介导的免疫治疗是一个极具吸引力的策略。本研究推测，毒素与趋化因子融合构成的新型免疫毒素，可能对高水平表达CCR9的急性T淋巴细胞白血病（T lineageacutelymphoblastic leukemia，T-ALL）细胞的存活产生影响。为了检验该假设，本研究设计一个免疫毒素分子CCL25-PE38，构建其真核表达载体，并表达在真核细胞293T中，然后检测其对T-ALL细胞系MOLT4的杀伤作用以及抗MOLT4细胞异种移植肿瘤效应。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂MOLT4细胞（自然高水平表达CCR9），小鼠成纤维细胞L929，HEK 293T细胞购自美国模式菌科收集中心，RPMI 1640、DMEM、胰酶来源于美国Hyclone公司，青霉素、链霉素购自美国Sigma公司，Fetal bovine serum（FBS）购自美国Gibco公司，限制性内切酶来源于美国NewEngland Biolabs公司，pcDNA3.1（+）载体来源于美国Invitrogen公司，Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System来源于Promega，EntransterTM-D来源于中国Engreen，重组人-CCL25来源于美国Peprotech公司，鼠抗人CCR9单克隆抗体购自美国R&D公司，BCA蛋白分析试剂盒购自碧云天生物有限公司，过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG，FITC/R-PE标记羊抗兔IgG，R-PE标记驴抗鼠IgG（H+L）来源于美国Protein Tech公司，Annexin V-FITC试剂盒来源于美国BD公司，细胞增殖试剂WST-1来源于美国Roche公司，甘油来源于美国Sigma公司。

1.1.2主要仪器电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），Eppendorf PCR仪（德国Eppendorf AG公司），Air Tech超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），KHB CT-360自动多功能酶标仪（上海科华实验系统有限公司），GENE GENIUS凝胶成像分析系统（英国Syngene公司），Eppendorf移液器（德国Eppendorf AG公司），Eppendorf台式冷冻离心机（德国Eppendorf AG公司），蛋白电泳仪、转印仪（北京六一），Transwell趋化小室（美国Corning公司），细胞培养箱（美国Forma公司），倒置显微镜（日本Nikon公司），流式细胞仪（美国Beckman公司），共聚焦显微镜（德国Leica）。

1.2实验方法

1.2.1重组免疫毒素CCL25-PE38靶向杀伤MOLT4细胞实验收集1×105MOLT4细胞，PBS洗涤。分别取CCL25-PE38、PE38（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0及2.0 nmol/ml，PBS稀释），加至细胞悬液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS处理作为阴性对照组。37℃、二氧化碳CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养48 h后，加入10μl WST-1（美国Roche公司）继续培养4h。酶标仪测定450nm下的光密度（optical density，OD）值。同时为检测CCL25-PE38对MOLT4细胞的特异性杀伤作用依赖于CCR9，设立CCL25-PE38加抗CCR9抗体（美国R&D公司）处理组。收集MOLT4细胞，PBS洗涤1次。先用抗CCR9抗体处理1 h，然后加入CCL25-PE38。其他处理同上。为检测CCL25-PE38对CCR9-细胞增殖能力的影响，收集1×105L929细胞，PBS洗涤1次。取CCL25-PE38（0.5 nmol/ml，PBS稀释），加至细胞悬液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS处理作为阴性对照组。37℃、二氧化碳CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养48 h后，加入10μl WST-1继续培养4h。酶标仪测定450nm下的OD值。重组免疫毒素CCL25-PE38凋亡诱导效应，收集1×105MOLT4细胞，PBS洗涤1次。取CCL25-PE38（0.5nmol/ml，PBS稀释），加至细胞悬液中，混合物加至24孔板的各小孔中。37℃、二氧化碳CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养0、24及48 h。离心收集处理后的细胞，结合缓冲液洗涤1次，加入AnnexinV-FITC/PI（美国BD公司）于暗处孵育15 min。立即上流式细胞仪（美国Beckman公司）进行检测。

1.2.2重组免疫毒素CCL25-PE38抗肿瘤实验

MOLT4细胞异种移植肿瘤（CCR9+）模型建立：SCID小鼠由武汉大学动物实验中心提供，6～8周龄，雌性，许可证编号：SCXK（鄂）2008-2004。小鼠饲养在无菌隔离器中。一周后无菌条件下将MOLT4细胞接种至SCID小鼠背部皮下（1×107/只），接种后约7～9 d可触及到约300mm3大小的肿瘤块，将未长出肿瘤的小鼠弃掉不用，余下动物分成3组，每组5只。重组免疫毒素CCL25-PE38处理及抗瘤效果观察：于第9天开始分别经尾静脉注射（静脉注射不成功的采用腹腔注射）CCL25-PE38、PE38（0.5 nmol/只/d）、PBS；连续注射14 d。每隔一天测量瘤体的长和宽，并计算瘤体大小。至实验第29天，采取颈椎脱臼方式将SCID荷瘤小鼠处死，剥离肿瘤体并称重。HE染色：用4%中性甲醛固定剥离得到的肿瘤，送本校组织胚胎学教研室进行石蜡包埋、切片、HE染色。在显微镜下观察肿瘤块组织学特点。流式细胞术检测CCR9+肿瘤中CCR9的表达情况：无菌条件下碾磨肿瘤块，使用200目的细胞滤网收集肿瘤细胞，PBS洗涤2次。传代培养3次后，收集细胞检测其表面CCR9的表达水平。分离收集各处理组1×105细胞，加10μg/mL的抗CCR9单克隆抗体（美国R&D公司）至细胞悬液中，于4℃孵育1 h，以MOLT4细胞作为对照，加入PBS处理。PBS洗涤2遍后，加入RPE标记的羊抗鼠IgG（美国ProteinTech公司），4℃孵育30min。PBS洗涤2次后上流式细胞仪（美国Beckman公司）进行检测。

1.3统计学方法

采用Graph Prism 5统计软件进行数据分析，计量资料用均数比较的t检验处理和单因素方差分析，定性资料用独立样本R×C列联表资料的χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1免疫毒素CCL25-PE38靶向杀伤MOLT4细胞能力检测

为检测免疫毒素CCL25-PE38对细胞存活的影响，本研究检测免疫毒素CCL25-PE38对MOLT4细胞的杀伤作用以及对L929细胞增殖的影响。如图1所示，CCL25-PE38能特异性杀伤MOLT4细胞，随着免疫毒素CCL25-PE38浓度的增加其杀伤效应也随着增强，同时其杀伤作用能被抗CCR9的抗体特异性阻断。CCL25-PE38对CCR9表达阴性细胞的增殖无影响。

图1　免疫毒素CCL25-PE38细胞毒作用检测

2.2免疫毒素CCL25-PE38凋亡诱导效应

为探讨免疫毒素杀伤MOLT4细胞的机制，本研究检测免疫毒素诱导MOLT4细胞凋亡的作用。随着CCL25-PE38作用于MOLT4细胞时间的增加，发生凋亡的MOLT4细胞数（Annexin-V FITC阳性和Annexin-FITC、PI双阳性细胞）逐渐增加，见图2。24 h凋亡率为30.7%，48h凋亡率达到41.3%。与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见附表。

图2　免疫毒素CCL25-PE38诱导MOLT4细胞凋亡效应

附表　两组免疫毒素CCL25-PE38诱导MOLT4细胞凋亡效应的比较%

2.3免疫毒素CCL25-PE38抗CCR9+肿瘤效应

为进一步验证免疫毒素特异性杀伤白血病细胞的能力，本研究检测免疫毒素在体内抗CCR9+肿瘤作用。首先建立MOLT4细胞异种移植CCR9+肿瘤，接种MOLT4细胞9 d后，可检测到大小为300 mm3瘤体。然后注入CCL25-PE38并观察其对移植肿瘤生长的影响。如图3所示，注入CCL25-PE38 12d以后能观察到瘤体的的生长受到抑制。而PBS及PE38处理组瘤体的体积持续增长。因此，采用静脉注射重组免疫毒素CCL25-PE38能有效缓解SCID小鼠异种移植肿CCR9+瘤的生长。

图3　免疫毒素CCL25-PE38抑制异种移植CCR9+肿瘤的生长

2.4HE染色结果

为验证CCL25-PE38体内抑瘤作用，本研究制作肿瘤组织切片并作HE染色。通过组织学分析，发现CCL25-PE38处理组与对照组比较血管分布密度减少，肿瘤细胞数目明显减少。见图4。

图4　肿瘤组织HE染色结果

2.5CCR9+肿瘤中CCR9的表达水平

图5　不同处理组来源的肿瘤细胞表面CCR9表达水平

在本实验中，尽管免疫毒素CCL25-PE38能有效缓解异种移植CCR9+肿瘤生长，但是不能完全消除肿瘤。为探究产生此现象的原因，采用FCM检测了来源于各组瘤体中细胞表面CCR9的表达水平，结果发现在CCL25-PE38处理组，CCR9的表达水平明显降低（66.9%），而PBS和PE38处理组肿瘤细胞表面CCR9水平未有明显改变，见图5。因而可推测CCR9表达水平的下降可能与MOLT4细胞移植到小鼠体内后部分细胞不再表达CCR9有关。

3 讨论

趋化因子和趋化因子受体在疾病发生、发展的过程中发挥重要作用[4]。最近有研究报道，CCX282-B，一个潜在的人CCR9拮抗剂，对肠道炎症具有较好的治疗效果[5]。此外，文献[6]报道，下调CXCR4的表达抑制癌细胞侵袭和转移。针对趋化因子和/或趋化因子受体可能对控制相关疾病的发展进程具有治疗效果。CCR4单克隆抗体已被证明可以诱导T-ALL患者白血病细胞的死亡，抑制表达CCR4肿瘤的进展[7-9]。该作用导致细胞的死亡有赖于抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，但是该治疗方式与患者的免疫功能状态有关。而针对趋化因子或趋化因子受体与细胞毒性药物的免疫毒素，直接杀伤靶细胞可能提供更好的治疗效果。

PE38具有很强的诱导细胞死亡作用已被广泛用作免疫毒素的毒素成份[10-12]。在本研究中，WST-1检测结果显示，CCL25-PE38特异性杀死MOLT4细胞，但不杀伤L929细胞。重要的是靶向杀伤作用可被CCR9中和性抗体有效地阻断，再次确认CCL25-PE38对MOLT4细胞的杀伤作用是由CCR9介导的。随后Annexin V-FITC/PI染色的结果表明，CCL25-PE38呈时间依赖性诱导MOLT4细胞的凋亡。另一项研究报道与本研究一致的结果，VGEFPE38融合毒素进入胞浆后可诱导靶细胞凋亡[13-15]。此外，本研究通过向SCID小鼠注射MOLT4细胞建立白血病细胞荷瘤（CCR9+肿瘤）模型，探讨CCL25-PE38对异种移植CCR9+肿瘤生长的影响。在SCID小鼠白血病细胞移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能有效缓解CCR9+肿瘤的生长。经FCM检测发现瘤体（CCL25-PE38处理组）中分离的肿瘤细胞CCR9的表达水平下降，提示有可能一部分细胞在体内丧失表面CCR9分子，对CCL25-PE38产生耐受。因此，提高免疫毒素CCL25-PE38的抗肿瘤效果是本研究下一步的工作目标，可能通过以下途径：①生物信息学方法，优化CCL25-PE38结构，以增加CCL25-PE38活性；②提高CCL25-PE38的稳定性，以促进其吸收；③使用与其他治疗方法如化疗相结合的策略。另外，为进一步研究免疫毒素CCL25-PE38体内抗白血病作用，进行以下实验：建立小鼠白血病模型，观察CCL25-PE38治疗白血病效果；观察CCL25 -PE38的免疫原性、毒性、体内代谢等情况。

综上所述，本研究结果表明，免疫毒素CCL25-PE38能特异性杀伤高水平表达CCR9的MOLT4细胞，而不影响CCR9受体阴性细胞。此外，体内研究表明，CCL25-PE38能缓解CCR9+肿瘤的生长。所以，CCL25-PE38在此呈现的生物活性使其有可能成为潜在治疗高水平表达CCR9癌症潜在的生物制剂，特别是T-ALL。

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（张蕾编辑）

Study of CCL25-PE38 immunotoxin in treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）

Xiao-lei Liu1，Lei Gao2，Na Cui3
（1.Department of Hematology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；2.Ultrasound Department，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；3.Gynecology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China）

Objective To investigate the killing effect ofCCL25-PE38immunotoxin on MOLT4 cell line in T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）（CCR9natural high-level expression），and to provide the foundation of targeting treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）.Methods Flow cytometryn and confocal microscopy were used to detect the binding and internalization of CCL25-PE38 and MOLT4 cells.Transwell chemotaxis chamber method was used to detect the chemotaxis.Cell Proliferation Reagent WST and Annexin VFITC/PI stain were used to detect killing ability of cells and the apoptosis induced effect respectively.And antitumous effect ofCCI25-PE38was detected by building the SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model.Results WST-1 test showed thatCCL25-PE38produce specific lethal effect on MOLT4 cell. Annexin V-FITC/PI stain showed that the cause of death of MOLT4 cells was induced by apoptosis ofCCL25-PE38. Injection ofCCL25-PE38in SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model can retard growth speed of CCR9+cancer.Conclusions The cause of death of MOLT4 is induced by apoptosis-inducing effect of CCL25-PE38，which can retard the growth of CCR9+xenotransplanted tumors.

CCL25-PE38；T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）；immunotoxin

R 733.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.002

1005-8982（2016）20-0006-06

2016-02-18