养殖水中重金属对斑马鱼的急性毒性试验

伍爱梅，卫晋波，2，3，赖长生，于雪冰，刘颖云

（1.佛山英拜检测科技有限公司，广东佛山528000；2.佛山市环境健康与安全评价研究中心，广东佛山528000；3.广东微生物研究所，广东广州510070；4.佛山市禅城区粮油检测中心，广东佛山528000；5.中山市三乡镇畜牧兽医站，广东中山528463）

养殖水中重金属对斑马鱼的急性毒性试验

伍爱梅1，卫晋波1，2，3，赖长生4，于雪冰4，刘颖云5

（1.佛山英拜检测科技有限公司，广东佛山528000；2.佛山市环境健康与安全评价研究中心，广东佛山528000；3.广东微生物研究所，广东广州510070；4.佛山市禅城区粮油检测中心，广东佛山528000；5.中山市三乡镇畜牧兽医站，广东中山528463）

在静态的条件下，利用斑马鱼作为受试物，测试铊、钒、镍、锑、硒五种金属对斑马鱼的急性毒性。测试结果显示铊对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50分别是0.17、0.13、0.10、0.08mg·L-1；钒对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50分别是8.80、6.54、4.91、2.73mg·L-1；镍对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50分别是9.54、8.32、7.74、6.30mg·L-1；锑对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50分别是14.73、12.41、10.54、9.27mg·L-1；硒对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50分别是3.58、2.63、1.97、1.21mg·L-1。

重金属；急性毒性；斑马鱼

随着人类社会的发展，工业和生活废水的排放，造成的水体污染严重威胁了水生生物的生存环境，有害物质的急性毒性对人类健康产生巨大影响。其中，重金属作为主要污染物之一，能够和生物体内的蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性。

正因为重金属污染严重，容易造成公害，因此研究重金属的急性毒性和生物毒性是很必要的。现在很多研究会利用有害物质对斑马鱼的急性毒性的结果评价对生态环境进行评价。

我们通常用半数致死浓度来衡量有害物质对生物体的急性毒性大小。

吉首大学生物资源与环境科学学院对镍、镉对日本鳉及性毒性进行了研究，研究证明镍是中毒物质，96h-LC50是6.02mg·L-1；镉是高毒物质，96h-LC50是0.22mg·L-1。

国家水专项—流域水环境预警技术研究与三峡库区示范项目中，其中一个项目研究了5种重金属（汞、铜、镉、锌、铅）暴露对斑马鱼呼吸运动的影响结果表明，Hg2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+等重金属对斑马鱼的96h-LC50分别为0.14，0.174，6.497，44.48，116.432mg·L-1；安全浓度分别为0.014，0.017，0.65，4.5，11.6mg·L-1；应用呼吸参数的预警浓度分别为0.08，0.08，4.8，7.5，105mg·L-1。其中系列浓度Hg2+暴露下斑马鱼呼吸频率和呼吸强度都显著升高；Cu2+，Cd2+等暴露对斑马鱼呼吸频率和呼吸强度先升高再降低；Zn2+暴露则对斑马鱼呼吸运动具有显著抑制作用；而Pb2+对斑马鱼呼吸强度影响较小。斑马鱼呼吸参数作为生物监测指标来预警水体Hg2+，Cu2+，Zn2+等重金属污染较为敏感［1-8］。

日本研究锌对硬头鳟的急性毒性，重金属如锌、钻、铜、镍能溶解几种动物的红血球，且每种金属对试验动物的溶血作用，则具有种的特异性。其中锌对硬头鳟的红血球影响最大。据日本儿玉正昭的研究结果：硬头鳟在锌中毒后期，部分鳃上皮细胞脱落。此外，大马哈鱼的鱼卵也被重金属剥夺了弹性。

本实验将对铊、钒、镍、锑、硒五种金属对斑马鱼的急性毒性进行测试。旨在分析比较五种重金属的引起急性毒性反应，为水体、养殖以及食品污染检提供分析依据。铊虽然在环境中含量少，但由于最近频繁出现了铊中毒的事件，所以在此对铊的毒性做了研究，希望通过实验对铊的毒性有更深刻的了解。

斑马鱼为常见热带鱼，体长3～4 cm，身躯玲珑而纤细，易于饲养，发育快速，性成熟期短，繁殖力强，胚胎体外发育，易于观察和操作，而且其与人类基因有着87％的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，是研究脊椎动物的理想模型，其实验结果大多数情况下也适用于人体。

斑马鱼的基因和人类很相近，在本试验中，研究重金属对斑马鱼的急性毒性，也能很好的反映出重金属对人体的急性毒性。

由于斑马鱼的基因与人体相近，所以斑马鱼的卵细胞也被用来进行基因变异的研究。通过有害物质对斑马鱼的卵细胞的影响，观察斑马鱼的卵细胞结构，判断卵细胞是否产生变异。

1　实验生物、试剂及仪器

1.1受试生物

品种：斑马鱼

来源：广州杨氏水族馆

驯养：购买一定量的斑马鱼在相同的试验条件下驯养至少7天，保证自然死亡率小于5％［3］，试验前24小时停止喂食，急性毒性测定试验期间不喂食。

规格：从试验鱼中随机抽取10尾，试验鱼的长度为20.43～28.87mm，保证重量为0.152～0.332 g［3］。

饲养条件：鱼的生活环境就是水，对于鱼来说，水的质量直接影响到鱼的生存。所以在本试验中，为了得到准确的半数致死量的数据，严格控制养殖水的质量。养殖用水使用经过过滤和曝气的自来水，总硬度为69.88mg·L-1（以CaCO3计），pH值为7.80，水温控制在21.0～25.0℃，溶解氧不低于饱和值的60％（即不低于4.95mg·L-1）。

饲喂使用赤虫（本次试验饲喂的冷冻赤虫，必须先在水中解冻之后才能喂食，否则容易导致鱼生病死亡），每天一次。

光照每天12 h（早上10时～晚上10时）。

1.2重金属供试试剂

偏钒酸铵（佛山市安洋化玻仪器有限公司，天津市福晨化学试剂厂）；硝酸铊（西格玛奥德里奇中国）；硝酸镍（广州莱帆科学仪器有限公司，天津市福晨化学试剂厂）；醋酸锑（西格玛奥德里奇中国）；四氯化硒（西格玛奥德里奇中国）；钒标准溶液（浓度为1 000mg·L-1，广州志行仪器设备有限公司，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；铊标准溶液（浓度为1 000mg·L-1，广州志行仪器设备有限公司，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；镍标准溶液（浓度为1 000mg·L-1，广州志行仪器设备有限公司，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；锑标准溶液（浓度为1 000mg·L-1，广州奥谱析实验设备有限公司，国家有色金属及电子材料分析测试中心）；硒标准溶液（浓度为1 000mg·L-1，广州分析测试中心科力技术开发公司，环境保护标准样品研究所）

1.3仪器设备和试剂

仪器：原子吸收光谱仪（ICE 3500，赛默飞世尔科技）；双道原子荧光分光光度计（AFS 9800，北京海光仪器公司）；实验电热板（HT-300，中国广州分析测试中心）；鼓风干燥箱（HKG-9055A，广东环凯微生物科技有限公司）；电子天平（BSA 223S，赛多利斯）；溶解氧仪（Oxi3205，德国WTW）。

设备：铊空心阴极灯、镍空心阴极灯、钒空心阴极灯、硒空心阴极灯、锑空心阴极灯、捣碎机、聚乙烯瓶、5mL无菌注射器、0.45μm针孔式滤膜、0.22μm针孔式滤膜、玻璃鱼缸、一般试验室常用的仪器设备。

试剂：硝酸、高氯酸、硝酸钯、硝酸镁、过氧化氢、硼氢化钾（优级纯）、氢氧化钠、氩气（纯度不低于99.99％）。

检测用水：去离子水。

2　重金属对斑马鱼的急性毒性试验

2.1实验方法

试验方法参照《经济合作与发展组织化学品测试准则》［1］、《化学品测试方法》［2］、危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法［8］。暴露时间96 h，承载量（静态和半静态试验系统最大承载量为1.0 g鱼/L）。

2.2斑马鱼敏感性检查

为了证明试验中使用的斑马鱼健康水平属于正常状态，选择优级纯重铬酸钾为参考毒物，试验方法与重金属的毒性试验方法要求一致。若重铬酸钾的96h-LC50在200～400mg·L-1，即代表斑马鱼的健康水平属于正常，否则试验所使用的斑马鱼健康水平属于不正常，不能在试验中使用。

重铬酸钾经过105℃烘干2 h后，称取20.000 g，用养殖用水溶解并且准确定容到1 000.0mL，作为20 g·L-1重铬酸钾贮备液。然后分别量取60、80、100、120、140、160mL重铬酸钾贮备液置于不同的玻璃鱼缸中，再分别加入2 940，2 920，2 900，2 880，2 860，2 840mL养殖用水，使浓度分别为150，200，250，300，350，400mg·L-1。同时量取3 000mL养殖用水置于另一个鱼缸中，设定为空白样本作为对照。

在每一个鱼缸放10尾试验鱼，在各浓度中暴露24 h，试验期间不喂食。试验期间养殖水温度控制在21～25℃，光照时间为12 h。96 h后，试验结束，观察试验鱼的情况，记录死亡数量，通过spss统计软件计算重铬酸钾96h-LC50。

经试验，重铬酸钾参考毒物实验96 h后结束，96 h的LC50是298mg·L-1，重铬酸钾参考物96 h的LC50要求在200～400mg·L-1［3］之间，即本实验满足要求。结果证明了本试验中所选用的斑马鱼的敏感性和试验过程的有效性。

2.3预实验

为了分别得到重金属铊、钒、镍、锑、硒等五种重金属死亡率为100％的最低浓度和死亡率为0％的最高浓度，需要先进行预实验。

配制重金属贮备液。铊的贮备液浓度为10.0 g·L-1（称取硝酸铊13.0 g，用1％硝酸溶液10mL溶解，再定容至1 L）；钒的贮备液浓度为10.0 g·L-1（称取偏钒酸钠23.9g，用1％硝酸溶液10mL溶解，再定容至1 L）；镍的贮备液浓度1.0 g·L-1（称取硝酸镍5.0 g，用1％硝酸溶液10mL溶解，再定容至1 L）；锑的贮备液浓度10.0 g·L-1（称取醋酸锑24.6 g，用5％盐酸溶液10mL溶解，再定容至1 L）；硒的贮备液浓度为10.0 g·L-1（称取四氯化硒28.0 g，用5％盐酸溶液10mL溶解，再定容至1 L）。使用时将铊、钒、镍、锑、硒贮备液的浓度分别稀释至10.0，100，100，100，100mg·L-1。

进行预实验时铊选择浓度为0.01，0.10，0.20，0.50，1.0mg·L-1；钒选择浓度为1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 mg·L-1；镍选择浓度为1.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg·L-1；锑选择浓度为1.0，10.0，20.0，30.0，50.0mg·L-1；硒选择浓度为1.0，5.0，10.0，15.0，20.0mg·L-1。在25个鱼缸中分别配置铊、钒、镍、锑、硒五种重金属的五个浓度，每个鱼缸的养殖水用量为3 L，在每个鱼缸中放5尾试验鱼［3］，观察96小时，每天光照12小时（早上10点～晚上10点），养殖水温度控制在21～25℃，试验期间不喂食，不换水，记录斑马鱼的中毒情况和死亡数量。

试验结果：铊死亡率为100％的最低浓度为0.50mg·L-1，死亡率为0％的最高浓度为0.01mg·L-1；钒死亡率为100％的最低浓度为0.50mg·L-1，死亡率为0％的最高浓度为0.01mg·L-1；镍死亡率为100％的最低浓度为15.0mg·L-1，死亡率为0％的最高浓度为1.0mg·L-1；锑死亡率为100％的最低浓度为20.0mg·L-1，死亡率为0％的最高浓度为1.0mg·L-1；硒死亡率为100％的最低浓度为5.0mg·L-1，死亡率为0％的最高浓度为1.0mg·L-1。

2.4正式试验

根据预实验结果中重金属铊、钒、镍、锑、硒死亡率为100％的最低浓度和死亡率为0％的最高浓度，进行正式试验。在死亡率为100％的最低浓度和死亡率为0％的最高浓度之间，选择合适的浓度，铊选择浓度为0.01，0.05，0.10，0.20，0.30mg·L-1；钒选择浓度为2.0，5.0，8.0，10.0，15.0mg·L-1；镍选择浓度为2.0，5.0，8.0，10.0，15.0 mg·L-1；锑选择浓度为5.0，8.0，10.0，15.0，20.0 mg·L-1；硒选择浓度为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mg·L-1。在25个鱼缸中分别配置铊、钒、镍、锑、硒等五种重金属的五个浓度，每个鱼缸的养殖水用量为3 L，在每个鱼缸中放10尾试验鱼，观察96 h，每天光照12 h（早上10点～晚上10点），养殖水温度控制在21～25℃，在试验期间不喂食，不换水。观察斑马鱼的中毒情况和记录死亡数量。最后通过spss统计软件计算出试验鱼24，48，72，96 h的半数致死量。

指标测定：溶解氧、pH值、温度。试验开始后0，24，48，72，96 h各测定一次每个鱼缸中的温度、pH值和溶解氧，确保整个过程温度控制在21～25℃，pH值不低于6，溶解氧不低于空气饱和值的60％。

观察与记录：试验开始后0，24，48，72，96 h，分别观察和记录一次每个鱼缸中斑马鱼的状态和死亡数量。用玻璃棒轻触鱼尾，鱼没有反应即判定为死亡。

数据处理：使用spss统计软件对数据进行处理。

2.5结果

矿石矿物成分以磁铁矿为主，其次有黄铁矿、赤铁矿、假象赤铁矿、少量黄铜矿、磁黄铁矿等。脉石矿物主要有透辉石、金云母、绿帘石、透闪石、阳起石、绿泥石等。有时有残留的大理岩团块。呈脉状的方解石常常充填在矽卡岩矿物和磁铁矿石裂隙中。

经spss统计软件计算，铊、钒、镍、锑、硒对斑马鱼的24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50见表1。

表1　重金属对斑马鱼的LC50mg·L-1

试验过程中，养殖水pH的变化范围是7.20～7.54；温度变化范围是22.3～24.2℃；铊试验时溶解氧的变化范围是72％～92％；钒试验时溶解氧的变化范围是68％～92％；镍试验时溶解氧的变化范围是66％～92％；锑试验时溶解氧的变化范围是64％～92％；硒试验时溶解氧的变化范围是68％～92％。试验结束时，空白对照组和溶剂对照组中，斑马鱼的死亡率为0％，符合要求低于10％。

3　讨论与总结

3.1讨论

本试验过程中，存在其他因素可能导致斑马鱼的死亡，影响试验数据的准确性。例如，在试验过程中，配制试验养殖水的时所使用的酸可能导致斑马鱼的死亡（在配制铊、钒、镍的试验养殖水时使用了硝酸；在配制锑、硒试验养殖水时使用了盐酸）。为了排除硝酸和盐酸导致斑马鱼死亡，需要设置硝酸溶剂对照组和盐酸溶剂对照组。

在进行斑马鱼急性毒性正式试验之前，必须先进行预实验，找到合适的浓度范围。但是有时候只做一次预实验是不能得到合适的浓度范围，因此反复进行预实验，直到得到合适的浓度范围。

试验过程中，养殖水的pH值变化范围是7.20～7.54；温度变化范围是22.3～24.2℃；铊试验时溶解氧的变化范围是72％～92％；钒试验时溶解氧的变化范围是68％～92％；镍试验时溶解氧的变化范围是66％～92％；锑试验时溶解氧的变化范围是64％～92％；硒试验时溶解氧的变化范围是68％～92％。192 h后，鱼缸中重金属的浓度均不低于初始浓度的80％。

在硝酸溶剂对照组和盐酸对照组中，斑马鱼的死亡率为0％，可以排硝酸及盐酸对试验结果的影响。

根据有危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法标准［6］，96h-LC50＜0.1mg·L-1为剧毒，96h-LC50是0.1～1mg·L-1为高毒，96h-LC50是1～10mg·L-1为中毒，96h-LC50＞10mg·L-1为低毒。测试结果铊96h-LC50为0.08mg·L-1属剧毒物质，钒96h-LC50为2.73mg·L-1属中毒物质，镍96h-LC50为6.30mg·L-1属中毒物质，锑96h-LC50为9.27mg·L-1属中毒物质，硒96h-LC50为1.21mg·L-1属中毒物质。

3.2总结

从急性毒性养殖试验的结果可以看出，在铊、钒、镍、锑、硒五种重金属中，铊的96h-LC50最小，达剧毒标准，其次是硒、钒、镍、锑，均为中毒物质。

对于急性毒性强的物质在平时养殖的时候注意加强对养殖水的实时水样检测，以及养殖物的健康状态，警惕不明原因的养殖物死亡事件，及时发现和处理养殖水的污染问题。

［1］OECD.Guidelines for the testing of chemicals，NO.203 fish acute toxicity test［S］.Paris：OECD，1992：1-10.

［2］国家环境保护总局.化学品测试方法［M］.北京：中国环境科学出版社，2004：203.

［3］姜辉，宋伟华，袁善奎，等.GB/T31270.12-2014化学农药环境安全评价实验准则：鱼类急性毒性试验［S］.北京：中国标准出版社，2004.

［4］戴寅，马凤楼，郭世萍.中华人民共和国国家标准：急性毒性试验［S］.北京：中国标准出版社，2004.

［5］才冰，袁善奎，曲甍甍，等.360种农药制剂对斑马鱼的急性毒性研究［J］.农药科学与管理，2011，32（1）：31-34.

［6］张园，闫靖，赵青，等.GB/T21281.12-2007危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法［S］.北京：中国标准出版社，2008：1-5.

【责任编辑：邓军文dengjunwen69@126.com】

A study of acute toxicity of heavy metals in cultured water to zebra fish

WU Ai-mei1，WEI Jin-bo1，2，3，LAI Chang-sheng4，YU Xue-bing4，LIU Ying-yun5

（1.Foshan En-bio Detection Technology Co.，ltd，528000，China；2.Foshan Center for Environmental Health and Safety Assessment，528000，China；3.Guangdong Institute of Microbiology，510070，China；4.Testing Center of Food and Oil of Foshan Chancheng District，Foshan 528000，China；5.Animal Husbandry and Veterinary Station of Sanxiang Tower，Zhongshan 528463，China）

This paper discusses the acute toxicity of five heavy metals，thallium，vanadium，nickel，antimony and selenium，with cultured water to zebra fish in static condition.According to the experiments，the results showed that the acute toxicity of thallium quantity to zebra fish with 24h-LC50，48h-LC50，72h-LC50，96h-LC50were respectively 0.17mg·L-1，0.13mg·L-1，0.10mg·L-1，0.08mg/L.The acute toxicity of vanadium quantity to zebra fish with 24h-LC50，48h-LC50，72h-LC50，96h-LC50were respectively 8.80mg·L-1，6.54 mg·L-1，4.91mg·L-1，2.73mg·L-1.The acute toxicity of nickel quantity to zebra fish with 24h-LC50，48h-LC50，72h-LC50，96h-LC50were respectively9.54mg·L-1，8.32mg·L-1，7.74mg·L-1，6.30mg·L-1.The acute toxicity of antimony quantity to zebra fish with 24h-LC50，48h-LC50，72h-LC50，96h-LC50were respectively 14.73 mg·L-1，12.41 mg·L-1，10.54mg/L，9.27 mg·L-1.The acute toxicity of selenium quantity to zebra fish with 24h-LC50，48h-LC50，72h-LC50，96h-LC50were respectively 3.58mg·L-1，2.63mg·L-1，1.97mg·L-1，1.21mg·L-1.

heavy metals；acute toxicity；zebra fish

S965

A

1008-0171（2016）05-0071-05

2016-06-11

广东省省级科技计划项目（2014A040401002）；广东省科技计划项目（2011B010600001）；佛山高新区发展专项资金项目；佛山市高校和医院科研基础平台建设项目（2014AG10007）

伍爱梅（1990-），女，广东广州人，佛山英拜检测科技有限公司助理工程师。