小肠移植物的器官保存现状及展望

杨涛，沈中阳（天津市第一中心医院，天津 300192）

小肠移植物是所有腹部实体器官移植供体器官中对冷热缺血时限条件要求最为苛刻的[1-2]，但是低温静态保存技术沿用了近30年，已无法满足临床需求。

进行性加重的缺血/再灌注损伤（IRI）及后续的肠黏膜屏障破坏会直接导致菌群移位、再灌注后综合征及液体与电解质转移[3]，并增加急性排斥反应（AR）的风险[4]。目前，小肠的保存仍然依靠低温灌注及静态保存，未涉及小肠内腔的处理与维护[5]。早期的研究表明，器官保存液（UW液）低温静态保存小肠移植物9小时内，损伤较轻，但是这个时限难以满足大多数移植中心的实际需要[6]。

由于临床中小肠移植例数相对较少，风险较高，因此，关于小肠移植物临床保存及IRI的研究较少，而实验性研究较多，不能满足临床实际应用。本文就近年来小肠移植物器官保存的相关进展进行简要介绍。

1 IRI

小肠与其他移植物类似，缺血/再灌注过程会导致各种细胞类型及组织成分的诸多变化。然而，小肠IRI的特殊之处在于代谢活动、伴随的污染及其解剖结构上的空腔结构。

由于低温保存的缺氧及低温环境，三磷酸腺苷（ATP）产生停止并逐渐耗竭，导致能量匮乏[7-8]。这会显著影响细胞结构及功能，例如跨膜转运、蛋白质的合成及运输、细胞骨架的完整等。尤其是对线粒体及内质网的破坏，造成呼吸链体系的破坏，均可导致细胞凋亡[9]。

能量供应匮乏还会造成肌动蛋白解聚，细胞骨架收缩，影响细胞间的紧密连接。紧密连接为跨膜蛋白复合体，对于维持细胞间连接及信号传输具有重要意义，能量供应匮乏会使紧密连接结构分解，其跨膜成分进入细胞质使细胞通透性增加，黏膜水肿、肠黏膜上皮破坏甚至肠黏膜脱落缺失[10-11]。再灌注过程中产生大量活性氧自由基，直接造成细胞破坏。氧自由基、脂质过氧化物及大量炎症因子（热休克蛋白、HMBP-1、S-100蛋白等）被动地释放或主动分泌，通过与Toll样受体4 （TLR-4）结合激活宿主的损伤相关模式分子（DAMP）信号通路，包括NF-κB通路、ERK1/2通路及p38丝裂原活化蛋白激酶通路[12]，加重炎症反应，嗜中性粒细胞聚集及组织破坏[13]。

2 临床常用保存方式

除了快速降温及去除残余血液的作用外，灌注保存还要防止缺血缺氧期间细胞肿胀，维持代谢平衡。目前，临床常用器官保存液原位低温灌注及静态低温保存，主要选择UW液，近年来HTK保存液也有增加趋势[14-15]。目前对于HTK保存液的应用存在质疑，但缺乏与UW液系统性的比较研究[16]，仅一项研究对比了两种保存液，平均保存时间8.5小时，术后90天生存率无统计学差异[17]。

Olson等[18]研究发现，UW液保存4小时小肠开始出现上皮水肿，其后逐渐加重，保存至12小时后，细胞水肿加重，黏膜下层也开始水肿，而肉眼形态并无明显改变。Roskott等[19]研究表明，小肠的保存损伤严重程度与供体类型相关。符合器官获取和移植网络（OPTN）标准的供体，小肠重要的紧密连接蛋白（claudin-3）、热休克蛋白70等水平正常，病理结构完整。而不符合标准的小肠则结果相反[20]。

关于冷保存时间与IRI程度的病理学研究较少，但是两者间存在相关性[20]。经过8小时的UW低温保存，再灌注后出现充血水肿、渗血、中性粒细胞炎症、上皮细胞分离及黏膜的破坏。文献报道的最长的UW液保存时间为17小时[14]，HTK液为14小时[17]。HTK液保存14小时早期生存率良好，而UW液保存17小时后的早期生存率不明。

进行性IRI的早期临床表现是再灌注后综合征（PRS），具体表现为术中低血压，全身血管阻力及心输出量降低，肺动脉压升高，可导致肾功能衰竭及术后早期死亡[3]。冷保存时间延长还会导致菌群移位风险增加，如果冷保存时间在7小时之内，菌群移位发生率为14%，如果保存时间延长至9小时，则菌群移位发生率明显增加至76%[21]。在部分动物实验研究中，使用Celsior及Polysol保存也可以替代UW液及HTK保存液，其病理结果接近，但是保存12小时之内超微结构及炎症因子水平无明显优势[22-23]。但是啮齿类动物研究的缺陷在于保存损伤比人类发生更早，而灌注压力亦不同[24]，动物品种也会产生影响[25]。

3 改进策略

3.1 腔内保存：与实质性器官保存不同，血管灌注并不能充满空腔结构的小肠肠腔。腔内保存的基本原理是通过保存液浸泡提供给肠细胞与肝实质细胞、肾小管细胞等同样的保护。肠黏膜细胞膜是摄取营养物质、水及电解质的通道，通过ATP依赖性细胞外转运途径。跨膜蛋白形成紧密连接，调节细胞间的黏附及选择性的通透[26]。肠黏膜可以通过这种途径直接摄取液体或气体[27]。最佳的腔内保存液尚未明确，但是UW液血管灌注及腔内保存可以明显降低啮齿类及人类的小肠保存损伤[28]，但是这种高钾保存液的安全性尚存争议[29]。小肠移植模型的研究表明，单纯血管灌注保存开放后出现黏膜渗血，所有动物均在12小时内死亡，而腔内保存组7天生存率为100%，病理结果良好，能量供应充足，氧化应激反应较弱[30]。这些效应均与谷氨酰胺水平相关，它是肠细胞主要能量来源，是细胞存活重要保障[31-32]。使用含谷氨酰胺成分的聚乙二醇溶液进行腔内保存的动物实验结果证实，冷保存14小时肠细胞形态基本正常，凋亡不明显。低温保存期间，肠腔内保存液谷氨酰胺水平迅速降低，反映组织快速的摄取利用[33-34]。这些研究表明，冷保存期间对小肠移植物进行代谢支持的意义以及谷氨酰胺的重要性。图1为改进小肠移植物保存效果的策略。

图1 改进小肠移植物保存效果的策略，A-A：氨基酸；PEG：聚乙二醇；UW：UW保存液。

小肠保存损伤的重要标志是进行性的上皮水肿，导致黏膜破坏，黏膜及黏膜下层分离。研究表明，为防止细胞肿胀，保存液渗透压需要维持在110～140 mOsm/kg，因此，临床使用聚乙二醇替代羟乙基淀粉。Oltean等[33]临床试验证实，与单纯UW液血管灌注相比，使用含有低分子聚乙二醇成分（3350 a）的腔内保存液可减轻14小时之内的冷保存损伤[35-36]。而其他临床研究，例如HTK保存液添加聚乙二醇用于腔内保存，亦证实了此结论[37]。聚乙二醇可以形成肠细胞膜的保护性涂层，防止紧密连接蛋白的破坏。而高分子的聚乙二醇（15～20 000 Da）也有相同保护作用[37]。与聚乙二醇不同，右旋糖苷的保护作用与相对分子质量相关，较小的右旋糖苷保护作用较差（70 kDa）[38]，最佳的相对分子质量应该在2 400 kDa[39]。

3.2 气体干预：IRI的病理生理学原因是缺氧，提供氧气供应将会减轻损伤。研究证实，氧弥散灌注可以明显减轻大鼠、猪及人类供肝的再灌注损伤，提高ATP水平，促进恢复[40-42]。同样，冷保存期间腔内氧弥散也会提高肠移植物的能量供应，有利于维持肠黏膜的完整性[43]。但也有研究表明，长时间的腔内氧弥散会增加脂质过氧化作用，1小时的氧弥散足够[44]。而脂质过氧化作用，可在腔内含复合氨基酸的溶液中添加水溶性维生素Trolox拮抗[45]。其他气体也被用于减轻肠IRI，研究证实，外源性的低浓度一氧化碳（CO）可以产生明显的细胞保护作用[46-48]。在肠移植物低温保存期间，向充满UW液的肠腔内缓慢输送CO，可以改善肠屏障，下调促炎因子的表达，提高受体生存率[49]。在体内，CO吸入的安全性尚存争议，但是体外输注由于没有血红蛋白的干扰，不仅能够提高安全性，还可以提高利用效率。氢气与氮气也被用于类似研究，肠腔内给予富氢的UW液可以维持肠黏膜的完整性，减轻脂质过氧化作用，减轻炎症反应，提高受体的生存率。而氮气保护作用不明显[50]。

如果犬的小肠移植物使用UW低温灌注，其后浸泡在低温持续氧合的过氟化碳（PFC）的混合液中，保存24小时，小肠移植术后生存率为75%。而单纯UW低温保存的生存率为0%[51]。如果将含有氨基酸的保存液腔内保存与PFC保存相结合，可以明显提高大鼠肠移植物保存效果，而保存时间可延长至 40 小时[52-54]。

综上所述，小肠保存技术进展缓慢，与传统的UW液低温灌注保存相比，增加腔内保存液或气体输注均有利于提高保存效果，这些新进展均有一定证据支持，有待进一步的临床应用评价。