甘草内生菌有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷止咳作用的对比研究*

2016-11-09杨志军杜进娥付艳春

中医研究 2016年10期

关键词：水煎液总皂苷氨水

曼　琼,邓　毅,杨志军,赵　妮,杜进娥,付艳春

(甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000)

·实验研究·

甘草内生菌有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷止咳作用的对比研究*

曼琼1,邓毅1,杨志军1,赵妮1,杜进娥1,付艳春1

(甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000)

目的：研究甘肃乌拉尔甘草内生菌有效菌株与宿主水煎液、总皂苷、总黄酮止咳作用的差异。方法：采用小鼠氨水和SO2引咳法，以小鼠半数引咳时间(EDT50)、R值、咳嗽潜伏期、2 min内咳嗽次数、延长率、止咳率为指标，观察甘草有效菌株及宿主水煎液、总皂苷、总黄酮的止咳作用。结果：各有效菌株对氨水引咳所致小鼠EDT50均有所延长，JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB060、JTZB063均具有显著止咳作用(R>150%)，JTZB058有止咳作用(R>130%)。对SO2所致咳嗽，JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063均能延长小鼠咳嗽潜伏期，减少2 min内咳嗽次数，具有止咳作用(P<0.01或P<0.05)，与宿主作用相似。结论：甘草有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063与宿主有着相同的生理活性，并具有较好的止咳作用。

甘草；内生菌；有效菌株/药效学；总皂苷；总黄酮；止咳

甘草有祛痰止咳之效。研究表明，甘草具有缓和炎症对咽喉的刺激而达到中枢性镇咳作用[1]，其主要成分总皂苷、总黄酮有明显的止咳作用[2-3]。甘草内生菌可产生与其宿主甘草及有效成分总黄酮、总皂苷相同或相似的生理活性[4-6]。本实验选取栽培乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.) 分离培养内生菌，经体内、外抑菌实验筛选9株有效菌株进行体内止咳试验，比较其与宿主水煎液、总皂苷、总黄酮止咳作用的差异，为评价甘草内生菌止咳的药用活性提供依据。

1　材料与方法

1.1动物

健康昆明种小鼠370只，SPF级，雌性各半，体质量18～22 g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2药品、试剂与仪器

栽培乌拉尔甘草购于甘肃省酒泉市金塔县，经甘肃中医药大学生药实验中心高级实验师林丽老师鉴定为正品，将新鲜栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鲜膜分开包装，4 ℃保存。磷酸可待因，青海制药厂有限公司，批号20150124；生理盐水，西安京西双鹤药业有限公司，批号1503217B；无水乙醇(批号20160103)、无水亚硫酸钠(批号20151006)，天津市大茂化学试剂厂产品；乙酸乙酯，天津市富宁精细化工有限公司产品，批号20140701；氨水，天津市百世化工有限公司产品，批号20151011E；NA营养琼脂(批号20150122)、营养肉汤(批号20140826)，青岛高科园海博生物技术有限公司产品。LDZX-30FB立体压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；DHP-927电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；HJ-CJ-2D双人净化工作台，上海苏静实业有限公司产品；BS-110S型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；空气JLN-2302AS型压缩雾化器，深圳市新鸿镁医疗器械有限公司产品。

1.3甘草内生菌有效菌株[7-8]

甘草内生菌有效菌株的制备参照文献[7-8]。本实验所用的9株有效菌株为JTZB002，005，006，014，020，043，058，060，063，均为前期将甘草分离、培养、纯化得到的内生菌，再采用体外菌饼法、体内小鼠腹腔感染造模，筛选出的对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌均具有抑菌作用的菌株。

1.4甘草水煎液的制备

甘草破碎至1～3 mm长度，取30 g，加水300 mL，浸泡30 min，武火加热，文火煎煮60 min，纱布滤过，滤液水浴浓缩至50 mL(含生药量0.6 g/mL)，冰箱保存备用。

1.5总皂苷与总黄酮的提取分离

取适量栽培乌拉尔甘草粉末，精密称定，加入10倍量800 mL/L乙醇，超声提取40 min，浸提温度40 ℃，过滤，浓缩，加25 g/100 g氨水调pH值至11～12，乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，浓缩至固体，即得粗总黄酮，纯度为70%。合并水层，加盐酸调pH值至1～2，于4 ℃冰箱静置，离心，取沉淀，干燥至恒重，即得粗总皂苷，纯度为41%。

1.6有效菌株发酵液的制备

营养肉汤培养基按每瓶300 mL分装于500 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。将已活化的内生细菌有效菌株于无菌操作台上用接种环挑取5环菌种，接种于已灭菌的液体培养基中，于摇床28 ℃、200 r/min条件下培养4 d，将发酵液于4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液过滤，60 ℃烘干。

1.7分组与给药

将小鼠按数字随机表法分为14组，其中氨水引咳法试验每组14只、SO2引咳法试验每组12只，即空白组、阳性组、水煎液组、总皂苷组、总黄酮组和有效菌株JTZB002、JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB058、JTZB060、JTZB063。空白组给予生理盐水20 μL/g；阳性组给予磷酸可待因0.03 g/kg；水煎液组给予甘草水煎液1.3 g/kg(相当于甘草临床日等效用量);总皂苷组给予稀释液0.03 g/kg;总黄酮组给予稀释液0.006 g/kg；各有效菌株组分别给予发酵液，给药剂量同水煎液组。各组药物蒸馏水稀释后等容积灌胃，1次/d，连续7 d。

1.8引咳方法

1.8.1小鼠氨水引咳法

末次给药1 h后，小鼠放入250 mL的广口瓶中，用25 g/100 g氨水喷雾刺激，按序贯法改变氨水喷雾时间[9]，观察小鼠1 min内的咳嗽次数。计算小鼠半数引咳时间(EDT50)，并根据公式计算R值(R值>130%，认为有止咳作用；R值>150%，认为有显著止咳作用)。

n为每组动物数，c为rx的总和，r为每刺激时间下的动物数，x为刺激时间的对数。

序贯法测小鼠半数引咳时间，即预先设定一个喷雾时间20 s，相邻各时间对数差为0.1，其余各刺激时间分别为10.0，12.6，15.9，20.0，25.1，31.6，39.8，50.1，60.6 s 9个等级时间，刺激完成后观察小鼠1 min内典型咳嗽次数(以小鼠腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴为典型咳嗽)。若≥3次，记为有咳嗽(+)；若<3，记为无咳嗽(-)。若前一只“有咳嗽”，后一只用低一级时间刺激；反之，用高一级时间刺激。每组第一只小鼠刺激时间为20 s。

1.8.2小鼠SO2引咳法[10]

动物分组、给药同1.7。末次给药1 h后，取0.5 g 无水亚硫酸钠放入25 mL蒸发皿，迅速滴入体积分数500 mL/L硫酸溶液5 mL，立即用500 mL的玻璃烧杯扣住蒸发皿，计时1 min，此时烧杯内充满恒定浓度(1∶50 000)的SO2气体。迅速将小鼠放入，观察咳嗽情况，记录小鼠咳嗽潜伏期(从小鼠放入烧杯到出现第一声咳嗽的时间)及2 min内典型咳嗽次数，计算延长率及止咳率[11]。

1.9统计学方法

2　结　果

2.1氨水引咳法测定结果

与空白组对比，各实验组小鼠氨水引咳所致EDT50均有所延长。根据R1值，JTZB058有止咳作用(R>130%)；阳性组、水煎液组、总皂苷组、总黄酮组、JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB060、JTZB063均具有显著止咳作用(R>150%)；JTZB002无止咳作用(R<130%)。根据R2值，JTZB005、JTZB006、JTZB043止咳作用优于水煎液组(R>130%)；JTZB060、JTZB063止咳作用显著优于水煎液组(R>150%)。根据R3、R4值，JTZB005、JTZB006、JTZB043止咳作用优于总皂苷(R>130%)，JTZB060、JTZB063止咳作用显著优于总皂苷与总黄酮(R>150%)。见表1,2。

表1　小鼠氨水引咳法的测定结果记录

续表1　小鼠氨水引咳法的测定结果记录

表2　小鼠氨水引咳法半数引咳时间(EDT50)及R值结果对比

注：R1值，与空白组对比；R2值，与磷酸可待因组对比；R3值，与总皂苷组比较；R4值，与总黄酮组对比。*R>130%，有效；**R>150%，显效。

2.2SO2引咳法测定结果

与空白组对比，阳性组、水煎液组、总皂苷组、总黄酮组、JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063组小鼠咳嗽潜伏期显著延长，2 min内咳嗽次数显著减少(P<0.01或P<0.05)；JTZB014组咳嗽次数显著减少(P<0.05)，但咳嗽潜伏期无显著延长(P>0.05)。JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063组咳嗽潜伏期、2 min内咳嗽次数和止咳率，与水煎液组、总皂苷组及总黄酮组对比，差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　小鼠SO2引咳法结果

注：与空白组对比，*P<0.05，**P<0.01；与水煎液组对比，#P<0.05，##P<0.01；与总皂苷组对比，△P<0.05，△△P<0.01；与总黄酮组对比，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3　讨　论

内生菌是生活在健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，与宿主在长期进化过程中发生基因重组并获得宿主植物的基因，能够产生与宿主相同或相似的药用活性成分。利用微生物对传统中药进行研究与开发，既可以寻找天然植物药的新药源，又可以解决濒危药材资源匮乏问题。止咳作用的实验研究多采用机械刺激、化学刺激和电刺激。本实验采用接近病理效应的化学刺激方式，以氨水及SO2刺激引咳法，观察甘草有效菌株与其宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对引咳模型小鼠止咳作用的差别。综合比较，有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063对氨水和SO2刺激均有明显止咳作用；其中，JTZB060、JTZB063止咳作用显著优于宿主水煎液、总黄酮、总皂苷；JTZB005、JTZB006、JTZB043与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷作用相似；JTZB014、JTZB020、JTZB058对氨水刺激有止咳作用，对SO2刺激无明显止咳作用；JTZB002对氨水和SO2刺激均无明显止咳作用。提示甘草有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063与宿主有着相同的生理活性，并具有较好的止咳作用。

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(编辑陶珠)