复发性生殖器疱疹sHLA-G及外周血T细胞亚群和NK细胞的表达

黄　蓉　刘　剑　熊洪平　叶尚勉



复发性生殖器疱疹sHLA-G及外周血T细胞亚群和NK细胞的表达

黄蓉刘剑熊洪平叶尚勉

目的：明确复发性生殖器疱疹(RGH)患者治疗前后外周血T细胞亚群和NK细胞及sHLA-G水平变化。方法：采用酶联免疫吸附法和流式细胞仪分别检测60例RGH患者治疗前后血浆sHLA-G水平及外周血T细胞亚群和NK细胞表达。结果： RGH患者血浆sHLA-G水平治疗前后分别为(11.03±14.57) U/mL和(0.41±0.45) U/mL，差异有统计学意义(P<0.05)； NK细胞治疗前后分别为(15.01±5.89)% 和(17.72±5.56)%，差异有统计学意义(P<0.05)。CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。结论：外周血sHLA-G及NK细胞表达可能与RGH患者病情发展有关。

复发性生殖器疱疹；sHLA-G；T细胞亚群；NK细胞

生殖器疱疹(genital herpes，GH)由单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)感染泌尿生殖器及肛周皮肤黏膜引起的一种慢性、复发性、难治愈的性传播疾病，其临床表现为红斑、水疱及糜烂[1]。目前大量研究已证实复发性与HSV感染时的免疫功能紊乱有密切关系。本研究主要通过对复发性生殖器疱疹(Recurrent genital herpes，RGH)患者治疗前后的外周血T细胞亚群、NK细胞表达水平及sHLA-G水平的测定，了解RGH患者免疫功能的变化，有助于临床医生评估RGH患者的细胞免疫功能状态及评价治疗的疗效。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2012年1月至2014年6月我院皮肤性病科就诊的60例复发性生殖器疱疹患者，其中男24例，女36例，年龄21～62岁，平均(37.4±9.97)岁，病程3个月～3年，平均(1.8±0.4)年。所有患者均有典型的症状、皮损及反复发作史，且复发次数在3～6次/年，所有患者均排除自身免疫性疾病及其它系统性疾病，且半年内未接受任何免疫调节剂治疗；所有患者治疗前肝、肾功能检查、血常规检查无异常；同时收集42例我院健康体检者作为对照组，其中男15例，女27例，年龄23～62岁,平均(36.5±10)岁，两组性别、年龄比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法采集60例RGH患者和42例健康体检者空腹肝素抗凝血2 mL各两份，2 mL分离成血浆、2 mL抗凝血，并放置-30℃保存备用；60例患者开始服用盐酸伐昔洛韦(丽科分，湖北科益药业股份有限公司)0.3 g，每日2次，连续服用15天；匹多莫德片(万适宁，太阳石药业有限公司)0.8 g，每日2次，连续服用30天，为一疗程；所有患者服用3个疗程后随访，同时采集患者空腹肝素抗凝血2 mL各两份，2 mL分离成血浆、2 mL抗凝血，并放置-30℃保存备用。

1.3外周血T细胞亚群测定采用美国BECKMAN公司Cytomics FC 500 MCL流式细胞仪，试剂采用BECKMAN公司淋巴细胞亚群检测试剂盒。按照试剂说明书中的步骤操作后上机，Cytomics FC 500 MCL流式细胞仪软件自动分析，得出结果。

1.4血浆sHLA-G检测血浆sHLA-G的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自四川新创生物科技有限公司(产品批号：2013-01-22)，操作按试剂盒说明书中的步骤进行。

2　结果

2.1患者组与对照组外周血T细胞亚群活性和血浆sHLA-G水平的检测结果CD3+T细胞(总T细胞)数量在健康对照组为(72.91±7.46)%，在RGH患者组为(69.17±7.66)%，两者的差异具有统计学意义(t=2.453，P=0.016,P<0.05)，说明RGH患者CD3+T细胞数量低于健康对照组；血浆sHLA-G水平在健康对照组为(0.29±0.37)U/mL，在RGH患者组为(11.03±14.57)U/mL，两者的差异具有统计学意义(t=4.769，P=0.000,P<0.05)，说明RGH患者血浆sHLA-G水平高于健康对照组；其他指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　RGH患者组与对照组外周血T细胞亚群活性和血浆sHLA-G水平的比较±s)

表2　RGH治疗前与治疗后外周血T细胞亚群活性和血浆sHLA-G水平的比较±s)

3　讨论

HLA-G(human leucocyte antigen-G)是非经典HLA-l类分子，包括膜结合型的(mHLA-G)和可溶型(sHLA-G)。主要表达于胎盘组织、男性生殖细胞、移植组织、皮肤及感染组织等[2]。HLA-G对免疫的调节作用包括：(1)与自然杀伤细胞(NK)表面的杀伤细胞Ig样受体(killer cell Ig-like receptor，KIR)直接作用，抑制NK细胞的溶细胞功能；通过凋亡机制导致NK细胞死亡进而抑制NK细胞的溶细胞功能[3]。(2)与KIRs相互作用下调CD4+及CD8+T细胞的活性。抑制CD4+T细胞增殖和诱导CD8+T细胞凋亡；在靶细胞表面的表达可以直接抑制CD8+T细胞的杀伤溶解作用。(3)与CD8+T细胞结合上调Fas配体(FasL)的表达及可溶性Fas的分泌，通过Fas/FasL途径来诱导活化的CD8+T细胞和NK细胞凋亡[4,5]。

已报道HCMV、HSV-1、HIV-1、狂犬病毒、HCV等病毒感染中，HLA-G具有逃逸免疫监视的作用[6,7]。而在HSV病毒感染中，HSV诱导感染神经元和相邻神经元高度表达HLA-G来逃逸宿主免疫监控。HSV感染所导致的自发性流产患者绒毛膜外细胞滋养层细胞选择性也表达HLA-G[8,9]。

RGH主要是由HSV所导致的复发性、难治性性传播疾病，研究已证实，免疫因素在该病发展过程中至关重要，尤其在细胞免疫方面，表现为患者外周血T细胞亚群失衡，CD4+T细胞减少，CD8+T细胞不变或稍微减少，NK细胞的活性降低，进一步证明了细胞免疫功能紊乱在GH发病中的重要地位[10,11]。

本研究通过对60例RGH患者治疗前后外周血T细胞亚群活性和血浆sHLA-G水平的检测，了解RGH患者通过抗病毒药物和免疫调节剂治疗前后的细胞免疫状况及sHLA-G水平的变化，结果显示：RGH患者治疗前存在免疫紊乱，与健康人群比较CD3+T细胞(总T细胞)数量减少(t=2.453，P<0.05)；CD4+T细胞数量、CD3+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞数量变化不大(P>0.05)，表明RGH患者存在免疫功能降低的现象，但T细胞亚群变化并不大，结果与前述报道不一致，这一结果可能与我们观察周期短有关；而RGH患者血浆sHLA-G水平高于健康人群(t=4.769，P<0.05)，据此推测：HSV感染时所致的sHLA-G在RGH患者体内的高表达，可能会导致T细胞亚群活性发生改变。

目前临床治疗RGH普遍采用抗病毒药物和免疫调节剂联合治疗方案，伐昔洛韦是一种特异性疱疹病毒抑制剂，为阿昔洛韦的L-纈氨酸酯，在体内通过伐昔洛韦水解酶迅速并完全转化为阿昔洛韦和纈氨酸来发挥病毒抑制作用，具有利用率高、半衰期长、见效快等优点，可以选择性的抑制病毒DNA聚合酶使其失去活性，从而阻止病毒复制，临床运用已取得满意的疗效[12]。匹多莫德是一种新型的免疫促进剂，是焦谷氨酸和硫代脯氨酸合成的类二肽。匹多莫德具有调节非特异性和特异性免疫功能的作用，能激活NK细胞，促进有丝分裂原引起的淋巴细胞增殖，增强其介导的细胞毒活性，从而提高单核细胞的吞噬能力，增强中性粒细胞的趋化作用，并能抑制胸腺细胞的凋亡，促进淋巴细胞增殖，复原CD4+/CD8+比值，使细胞免疫功能低下时下降的CD4+/CD8+比值回升到正常，促进IL-2、IFN-γ的分泌，并增加淋巴细胞对IL-2的敏感性，诱导Th0向Thl转化，有利于增强免疫系统对抗病毒的能力[13,14]。因此两药联用治疗RGH患者的病情和控制复发具有良好的治疗优势，本研究中对RGH患者口服盐酸伐昔洛韦联合匹多莫德片治疗3个月后检测发现，患者NK细胞的数量高于治疗前的水平(t=2.592，P<0.05)，而CD3+T细胞数量、CD4+T细胞及CD8+T细胞的差异无统计学意义(P>0.05)；血浆sHLA-G水平低于治疗前(t=5.643，P<0.05)，表明治疗后RGH患者NK细胞活性增高，sHLA-G表达水平下调，这一结果可能是药物通过抑制病毒复制和激发淋巴细胞活性两个方面的作用，降低RGH患者疗后血浆sHLA-G表达水平，使sHLA-G对免疫细胞的抑制作用不能发挥，来达到NK细胞活性增高，提升RGH患者体内免疫细胞的免疫监视功能，从而控制RGH患者病情和减少复发，因此本研究结果在理论上为临床治疗RGH提供了依据。

[1] 张学军.皮肤性病学[M].第8版.北京:人民卫生出版社,2013.232-233.

[2] Alvaro G, Vera R, LeMaoult J, et al. The immunosuppressive molecule HLA-G and its clinical implications[J]. Cri Rev Cli Lab Sci,2012,49(3):1040-8363.

[3] Zhang WQ, Xu DP, Liu D, et al. HLA-G1 and HLA-G5 isoforms have an additive effect on NK cytolysis[J]. Human Immunology,2014,75(2):182-371.

[4] Chen BG, Xu DP, Lin A, et al. NK cytolysis is dependent on the proportion of HLA-G expression[J]. Human Immunology,2013,74(3):286-575.

[5] 吴凤霞,武丽君,罗雄燕.人白细胞抗原G 14 bp插入/缺失多态性和血浆可溶性人白细胞抗原G表达水平与系统性红斑狼疮的相关性研究[J].中华临床医师杂志,2010,4(2):144-149.

[6] Roberta R, Daria B, Olavio R, et al. New Insights into HLA-G and inflammatory diseases[J]. Inflammation & Allergy-Drug Targets,2012,11(6):1871-5281.

[7] Marie-LF,Vincent M, Manuel RC, et al. Role for proteases and HLA-G in the pathogenicity of influenza A viruses[J]. J Cli Virol,2011,51(3):1386-6532.

[8] Mégret F, Prehaud C, Lafage M, et al. Modulation of HLA-G and HLA-E expression in human neuronal cells after rabies virus or herpes virus simplex type 1 infections[J]. Hum Immunol,2007,68(4):294-302.

[9] Lafon M, Prehaud C, Megret F, et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections[J]. J Virol,2005,79(24):15226-15237.

[10] 李萍,邵路平.复发性生殖器疱疹患者血清细胞因子的表达及机体细胞免疫功能的研究[J].内蒙古中医药,2010,29(15):106-107.

[11] 莫翔,韦又铭.复发性生殖器疱疹患者免疫细胞功能研究进展[J].医学综述,2012,18(15):2385-2387.

[12] 郑桂香,张玉,余兰.伐昔洛韦联合胸腺肽肠溶片间歇疗法对复发性生殖器疱疹的预防效果[J].广东医学,2014,35(2):280-281.

[13] Riboldi P, Gerosa M, Meroni PL. Pidotimod: a reappraisal[J]. Int J Immunopathol Pharmacol,2009,22(2):255-262.

[14] 杜德荣,黄绍宽.伐昔洛韦联合匹多莫德治疗复发性生殖器疱疹的疗效及对IL-2、IFN-γ表达的影响[J].皮肤性病诊疗学杂志,2014,21(1):26-28.

(收稿：2015-06-08修回：2015-09-09)

Expression of plasma sHLA-G, T lymphocyte subsets and NK cells in patients with recurrent genital herpes

HUANGRong,LIUJian,XIONGHongping,YEShangmian.

DepartmentofDermatology,SecondHospitalofChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610041,China

LIUJian,E-mail: 409516734@qq.com

Objective: To determine the change of the level of T lymphocyte subsets, NK cells plasma and sHLA-G in the patients with recurrent genital herpes (RGH) before and after treatment. Methods: The level of plasma sHLA-G was detected by the enzyme linked immunosorbent assay and the levels of T lymphocyte subsets and NK cells were detected by the flow cytometry in 60 patients. Results: The level of NK cells in the patients before and after treatment was (15.01±5.89) % and (17.72±5.56) %, with a significant difference (P<0.05). The level of sHLA-G was (11.03±14.57) U/mL and (0.41±0.45) U/mL, with a significant difference (P<0.05). There was no significant difference in the levels of CD3+T cells, CD4+T cells, CD8+T cells and CD4+/CD8+in the patients before and after treatment. Conclusion: sHLA-G and NK cells may be related to the development of RGH.

RGH; sHLA-G; T lymphocyte subsets; NK cells

四川省教育厅重点科研项目(编号：11ZA067)

成都中医药大学第二附属医院皮肤科，成都，610041

刘剑，E-mail: 409516734@qq.com