D-半乳糖诱导性亚急性衰老大鼠模型皮肤胶原代谢及相关通路分子的表达

纪秀军　闫丙健　赵彩玲



·论著·

D-半乳糖诱导性亚急性衰老大鼠模型皮肤胶原代谢及相关通路分子的表达

纪秀军1闫丙健2赵彩玲2

目的：明确D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠皮肤胶原代谢及TGFβ1/smads通道分子的表达。方法：20只大鼠随机分为对照组和衰老组，衰老组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg·d，连续6周，对照组以同样的方法注射相同剂量的无菌生理盐水。活体皮肤共聚焦显微镜观察两组大鼠皮肤胶原纤维密度的变化。RT-PCR检测TGFβ1、Smad3、 I 型前胶原蛋白、III型前胶原蛋白及脂质金属蛋白酶抑制剂-1的mRNA水平。结果：衰老组大鼠皮肤胶原纤维密度及TGFβ1、Smad3、I型前胶原蛋白、脂质金属蛋白酶抑制剂-1 mRNA均低于正常对照组(P<0.05)；脂质金属蛋白酶-1 mRNA表达量高于对照组(P<0.05)；III型前胶原蛋白mRNA表达量在两组间没有差异。结论：D-半乳糖可通过下调TGFβ1/Smads通路分子的表达量抑制I型前胶原蛋白合成，并通过调节脂质金属蛋白酶-1/脂质金属蛋白酶抑制剂-1促进胶原蛋白降解，使皮肤出现亚急性衰老效应。

D-半乳糖；大鼠衰老模型；胶原代谢；TGFβ1/smads通路

D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠模型作为一种简便、易行、经济的动物模型制作方法，已被广泛用于器官衰老研究和药物试验[1]。但是其诱导皮肤衰老的机制目前仅在自由基方面予以探究，而其对胶原蛋白代谢状况及机制尚未明确[2,3]。本实验通过检测试验大鼠皮肤组织学变化和基因水平来探究D-半乳

糖诱导亚急性大鼠衰老模型皮肤组织胶原代谢状况的变化及其可能病理机制，为皮下注射D-半乳糖作为一种诱导大鼠皮肤衰老的方法在胶原代谢方面提供一定的依据。

1　材料和方法

1.1主要实验仪器及试剂D-半乳糖；RNA提取、逆转录、扩增试剂盒；其余试剂均为市售分析纯；实验仪器：共聚焦显微镜(康奥微维TMvivascop1500，上海康奥实业发展有限公司,)；超声细胞粉碎仪(美国biotek公司)；离心机(德国eppendorf公司)；电子天平(中国赛飞公司)；荧光定量PCR仪(roche公司)。

1.2实验动物和方法

1.2.1实验动物本实验所选用大鼠均为健康雄性8周龄、体重(220±20)g、 Wistar大鼠20只 ,由青岛市药物研究中心提供。所有试验均按照动物学伦理道德标准进行。

1.2.2实验分组20只大鼠在经过适应性饲养1周后，随机分为A组(衰老组)和B组(正常对照组)，每组10只。

1.2.3动物模型建立将固体D-半乳糖溶解于无菌生理盐水中制作1%浓度的D-半乳糖溶液，A组颈背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg·d,连续给药42 d，制作成大鼠衰老模型[3]。B组大鼠采取同样的方法注射同等剂量的生理盐水。

1.3实验标本及取材方法第42 d，麻醉后5%硫化钠脱去大鼠背部皮肤毛发并处死大鼠，所有大鼠均于背部相同部位切取皮肤标本，部分组织以10%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋切片拟作形态学观察。其余部分立即以无菌液氮管冻存后置于-80℃冰箱待测。

1.4指标检测(1)分别在实验开始第7、14、21、28、35、42 d于共聚焦显微镜下观察活体大鼠背部皮肤真皮胶原纤维密度变化并留取图片，分别对不同时间段皮肤共聚焦显微镜下图片进行随机选取并分析。(2)组织学观察测量：HE染色后于40倍镜下于每张HE染色切片随机选取5个不重叠视野留取图片，IPP图像分析软件观察真皮厚度的变化，masson染色后于400倍镜下随机获取5个视野，IPP图像分析软件进行观察胶原纤维形态及密度变化。(3)RT-PCR检测皮肤I型前胶原蛋白(col I)、III型前胶原蛋白(col III)、脂质金属蛋白酶-1(MMP-1)、脂质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)、TGFβ1、Smad3 mRNA表达量(各因子引物见表1)，采用2-△△CT方法分析基因表达结果。

表1　各因子引物

2　结果

2.1活体皮肤共聚焦显微镜检测结果通过6次测量结果可见A组大鼠皮肤胶原纤维由致密逐渐变得稀疏(图1)；而正常对照组胶原纤维排列致密均匀，前后无明显变化(图2)。

2.2真皮厚度和胶原纤维面积的系统定量分析HE染色及masson染色可见衰老组皮肤厚度较正常对照组相比皮肤厚度及真皮厚度均减低，胶原纤维厚度变薄且皮肤胶原纤维排列疏松，胶原束细长、断裂、排列紊乱(图3)。Image pro plus(IPP)图像分析软件分别定量测量真皮厚度和胶原纤维密度，真皮厚度以IPP分析HE染色图片真皮表皮链接层到皮下脂肪层的距离表示。而胶原纤维面积IPP分析masson染色图片中胶原纤维蓝染颜色所覆盖的面积表示(蓝色区域面积)。测量结果示：衰老组大鼠真皮厚度和胶原纤维面积显著低于正常对照组(P<0.05)，差异具有统计学意义(图3、表2)。

表2　IPP图像分析软件对HE染色

2.3RT-PCR定量测量结果实时荧光定量PCR检测结果显示衰老组与正常对照组大鼠相比col I、TGFβ1、smad3 mRNA表达量均减少，差异有统计学意义(P<0.05)，col III基因表达量在两组间没有差异(P>0.05)，但是MMP-1 mRNA表达量在衰老组明显高于正常对照组(P<0.05)(表3)。

随D-半乳糖注射次数的增加，皮肤共聚焦纤维镜6次检测结果可见衰老组大鼠皮肤胶原纤维密度在第7、14、21、28、35、42 d呈现逐渐降低的趋势。

图1衰老组大鼠皮肤共聚焦显微镜检测结果

皮肤共聚焦纤维镜检测结果示：正常对照组大鼠皮肤胶原纤维密度在第7、14、21、28、35、42 d无明显改变。

a、b 可见衰老组皮肤厚度较正常对照组皮肤厚度及真皮厚度均减低(HE，×40)；c、d 可见衰老组大鼠皮肤胶原纤维排列疏松，胶原束细长、断裂、排列紊乱(masson×400)。

图3　大鼠皮肤组织HE染色和masson染色

注：*两组大鼠相比差异具有统计学意义

3　讨论

皮肤衰老模型的制作在人们研究衰老、抗衰老机制及抗药研发过程中扮演重要角色。目前关于皮肤衰老模型的制作方法常用的主要包括模拟紫外线照射法和D-半乳糖诱导法。模拟紫外线照射法是利用紫外线灯模拟外源性阳光中的紫外线对皮肤损伤为原理，每次照射的波长、角度、距离不同及大鼠毛发遮挡等因素都会对实验造成一定的误差，且皮肤衰老是一个复杂的既有内源性也有外源性因素造成的结果。而D-半乳糖诱导法具有简单、有效、方便、快捷的优点，且其可诱导包括皮肤、大脑、心、肾脏等全身各个器官衰老[1]，这个过程于人体自然衰老过程更为相近。所以从整体和平衡角度来看低剂量D-半乳糖诱导皮肤衰老的方法更加可靠。

低剂量D-半乳糖长时间皮下注射可导致机体细胞内半乳糖浓度增高。在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，从而导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，形成过量的超氧阴离子自由基。自由基过量产生是活性氧合成增加，活性氧加成到碱基的双键中破坏碱基生成嘧啶、嘌呤自由基，碱自由基相互结合或被过氧化，使碱基缺失甚至主链断裂，产生遗传突变[4,5]。从而严重影响遗传信息的正常转录和翻译，使胶原蛋白表达量降低甚至消失，另外衰老皮肤中胶原酶与其抑制剂代谢失调，引起胶原蛋白的异常分解。

真皮主要有细胞外基质(ECM)组成，而ECM的主要成分为胶原蛋白，皮肤胶原蛋白有20多种，其中I型胶原蛋白含量最高约占75%，其次为III型胶原蛋白。胶原蛋白参与皮肤的强度、弹性及稳定性，皮肤中胶原蛋白分解、萎缩可使皮肤变薄弹性降低导致皱纹的出现[6-8]。本实验研究发现衰老组大鼠胶原纤维密度及I型前胶原蛋白(col I)mRNA表达量及其体现在空间结构上的皮肤真皮厚度、细胞层数较正常对照组相比均降低。但是III型前胶原蛋白(col III)mRNA表达量在两组间并没有差异。数据表明低剂量D-半乳糖皮下注射42 d可导致大鼠皮肤I型前胶原蛋白合成减少从而导致皮肤真皮变薄，最终导致衰老的出现。

研究表明：胶原蛋白的降解与合成受到多种细胞因子的调节。TGFβ1作为组织纤维化的调控者，通过与成纤维细胞膜I、II型受体结合依次磷酸化下游smad2、smad3、smad4信号通路，磷酸化的smad2、smad3、smad4复合体作用于细胞核相应编码区参与并调控成纤维细胞中的纤维化基因(ColIa1,ColIa2,ColVa2,ColVIa1, and ColVIa3、TIMP-1)发挥其生物学作用[9]。研究发现， smad3是TGF-β1/Smads致纤维化信号传导通路中至关重要的环节[10,11]。本实验发现衰老组大鼠皮肤组织TGF-β1、Smad3 mRNA均减少，且col I mRNA表达量在衰老组大鼠皮肤组织也减少，数据表明D-半乳糖皮下注射可在基因水平上降低TGFβ1/smad3的表达量，从而进一步减少I型胶原蛋白合成达到皮肤衰老效应。

本实验还检测了皮肤MMP-1、TIMP-1 mRNA表达量。MMP-1通过裂解I型胶原蛋白末端的C位点从而启动其降解过程[12,13]。TIMP-1可以抑制MMP-1活性，且MMP-1/TIMP-1失衡可以导致过多的胶原蛋白降解[14,15]。最近研究发现TIMP-1是TGFβ1/smad3通路的下游产物[9]。我们的研究发现D-半乳糖可增加MMP-1 mRNA表达量，并降低TIMP-1 mRNA的表达量，MMP-1/TIMP-1比例失衡。我们的数据表明D-半乳糖皮下注射对皮肤胶原的作用也可以通过降低TGFβ1/smad3的表达量进一步降低TIMP-1的合成并促进胶原酶合成途径从而促进胶原蛋白的降解，达到亚急性皮肤衰老的效应。

低剂量D-半乳糖皮下连续注射42 d可导致大鼠皮肤I型前胶原蛋白合成减少，降低真皮细胞层数及厚度，从而导致衰老的出现。低剂量D-半乳糖皮下注射降低I型胶原蛋白合成与负调节TGFβ1/smads通路分子表达量密切相关。 D-半乳糖诱导衰老机制与通过负调接TGFβ1/smads通路分子表达量使MMP-1/TIMP-1平衡失调，促进胶原蛋白降解息息相关。这为低剂量D-半乳糖皮下注射与导致衰老关系的进一步探讨提供了思路。

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(收稿：2015-08-05修回：2015-10-09)

Expression of collagen metabolism and the related signaling pathway in skin aging rat models induced by D-Galactose

JIXiujun1,YANBingjian2,ZHAOCailing2.

1.LaiwuInstituteofDermatology,Laiwu271100,ShandongChina; 2.LaiwuPeople’sHospital,Laiwu271100,ShandongChina

Objective: To determine the expression of collagen metabolism and the related signaling pathway in skin aging rat models induced by D-Galactose. Methods: Twenty rats were randomly divided into the D-gal group and control group. Ten rats in the D-gal group were given subcutaneous injection of D-galactose, 125 mg/kg·d for 6 weeks. The rats in the control group were treated with the same volume of normal saline. The collagen density was detected by the confocal microscopy. The expression of Col I, Col III, MMP-1, TIMP-1, TGFβ1 and Smad3 mRNA was detected by RT-PCR. Results: The collagen density of rats and the level of Col I, MMP-1, TIMP-1, TGFβ1 and Smad3 mRNA were lower in the D-gal group than in the control group (P<0.05). The expression of MMP-1mRNA was higher in the D-gal group than in the control group. There was no significant difference in the level of Col III between the D-gal group and control group. Conclusion: D-Galactose inhibits the Col I synthesis through down-regulating the expression of TGFβ1/Smad3 and accelerates the degradation of collagen through regulating the balance between MMP-1 and TIMP-1, which makes the skin into subacute aging.

D-Galactose; rat skin aging model; collagen metabolism; TGFβ1/smads pathway

1山东省莱芜市皮肤病防治所， 山东莱芜，271100

2山东省莱芜市人民医院，山东莱芜，271100