超声萃取结合超高效液相色谱法测定皮革中10种防霉剂

吴玉銮，王　莉，罗海英，冼燕萍，董　浩，王　斌，韩婉清

(1.广州质量监督检测研究院，广东　广州　511447；2.国家皮革制品质量监督检验中心(广州),广东　广州　511447)



超声萃取结合超高效液相色谱法测定皮革中10种防霉剂

吴玉銮1,2*，王莉1,2，罗海英1,2，冼燕萍1,2，董浩1,2，王斌1,2，韩婉清1,2

(1.广州质量监督检测研究院，广东广州511447；2.国家皮革制品质量监督检验中心(广州),广东广州511447)

建立了皮革样品中10种防霉剂(氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水杨酰苯胺、OPP、TCMTB和OIT)的超高效液相色谱(UPLC)检测方法。样品经甲醇超声萃取，T3色谱柱分离后，甲醇和0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器测定。在优化条件下，10种防霉剂在一定的浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均不小于0.999 3，除IPBC的方法定量下限(S/N=10)为190.0 mg/kg外，其余9种防霉剂的方法定量下限为4.0～8.0 mg/kg，平均回收率为81.3%～104.9%，相对标准偏差(RSD，n=6)为4.7%～11.2%。该方法前处理简单、分离效果好，适用于皮革样品中10种防霉剂的同时测定。

皮革；防霉剂；超声萃取；超高效液相色谱(UPLC)

发霉是皮革及其制品最常见的质量问题。微生物的繁殖会引起原料皮、成品革的霉变，导致皮革的物理性能下降，严重影响皮革的销售和使用[1]，因此防止皮革霉变是皮革行业的热点问题之一。添加防霉剂是防止皮革霉变的有效方法。目前用于皮革工业的防霉剂主要有无机类(包括次氯酸及其盐、亚硫酸盐、无机纳米材料等),有机类(有机酚、醛类、酰胺类、杂环化合物等)[2-3]，如杂环化合物中的2-硫氰基甲基硫代苯并噻唑(TCMTB)、巯基苯并噻唑(MBT)、正辛基异噻唑啉酮(OIT)、1，2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)和苯并咪唑等，有机酚及卤代酚中的4-氯-3-甲基苯酚(PCMC)、邻苯基苯酚(OPP)、五氯苯酚(PCP)等，酰胺类化合物中的水杨酰苯胺、氨基苯磺酰胺等，酯类化合物中的碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)等。多数防霉剂在有效防止霉变的同时，对人类、动物、环境带来负面影响[4]，如异噻唑啉酮可引起皮肤灼伤或哮喘[5]；IPBC可导致接触性皮炎[6]；邻苯基苯酚等酚类防霉剂因生物毒性效应，在木材、食品接触材料和纺织品中被列为限用或禁用物质[7]。鉴于防霉剂对人体的潜在健康威胁，且国内标准未针对上述10种防霉剂在皮革中的使用进行规定，因此有必要开展皮革中氨基苯磺酰胺等10种防霉剂的检测方法研究。

目前国内外关于防霉剂检测的研究主要集中在化妆品[8-9]、食品[10-11]、酒[12]和水性涂料[13]等。有少量文献对皮革中TCMTB、OPP、BIT、水杨酰苯胺、IPBC和苯并咪唑等防霉剂进行了检测[5,14-18]，其中ISO 13365-2011规定了皮革中TCMTB、PCMC、OPP、OIT的检测方法，但未给出明确的检出限。防霉剂的测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等[19-22]，超高效液相色谱仪是化学实验室常配备的一种设备，在多残留组分分析中具有分离效率高和分析时间短的优点，可对防霉剂进行定性、定量测定。

本文针对皮革基质的特点，通过对色谱条件、萃取溶剂等实验条件的优化，采用超声萃取结合超高效液相色谱技术，首次建立了同时测定皮革中氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水杨酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT共10种常用防霉剂的超高效液相色谱(UPLC)方法。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

ACQUITYTM超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(UPLC，美国Waters公司)，MS2 Minshaker涡旋振荡器(德国IKA公司)，KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，N-EVAP 112水浴氮吹仪(美国OA公司)，KDC-400低速离心机(科大创新公司)，Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。

氨基苯磺酰胺(纯度≥99.0%)、苯并咪唑(纯度≥98.0%)、1，2-苯并异噻唑-3-酮(BIT，纯度≥98.0%)、巯基苯并噻唑(MBT，纯度≥98.0%)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC，纯度≥97.0%)及4-氯-3-甲基苯酚(PCMC，纯度≥99.0%)均购自上海阿拉丁试剂有限公司；水杨酰苯胺(纯度≥98.0%)、邻苯基苯酚(OPP，纯度≥97.0%)及正辛基异噻唑啉酮(OIT，纯度≥98.0%)均购自上海阿达玛斯试剂有限公司；2-硫氰基甲基硫代苯并噻唑(TCMTB，纯度≥90.0%，加拿大Toronto research chemicals公司)。甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯(色谱纯，美国Fisher公司)。

10个皮革样品(片状原料皮革，其中牛皮革5个，猪皮革3个，羊皮革2个)，来源于广州本地市场。

1.2标准工作溶液的配制

分别准确称取各标准物质10.0 mg，配成1 000 mg/L的标准储备溶液，置于4 ℃冰箱冷藏保存。其中苯并咪唑、BIT、IPBC、水杨酰苯胺、OPP及OIT用甲醇溶解定容制得标准储备溶液；氨基苯磺酰胺、MBT及PCMC用少量丙酮溶解、甲醇定容制得标准储备溶液；TCMTB用少量乙腈溶解、甲醇定容制得标准储备溶液。使用时，以甲醇逐级稀释成所需浓度的混合标准工作液。

1.3样品前处理

将皮革样品剪成约5 mm×5 mm小片，称取0.5 g样品于50 mL离心管中，加入5 mL甲醇，涡旋振荡1 min，超声30 min，4 000 r/min离心3 min，收集上清液于20 mL玻璃试管中。重复提取1次，合并提取液。提取液置于40 ℃水浴中氮气吹干，加入1.0 mL甲醇复溶，涡旋摇匀，过0.22 μm滤膜待测。

1.4超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇；流动相梯度洗脱程序：0～2 min，90% A；2～4 min，90%～50% A;4～25 min，50%～30% A;25～27 min，30%～10% A；27～29 min，10%～90% A;29～32 min，90% A；流速：0.2 mL/min；进样量：1.0 μL；紫外检测波长：230，275，320 nm；柱温：30 ℃。

2　结果与讨论

2.1仪器条件的优化

2.1.1检测波长的选择利用PDA检测器在200～400 nm波长范围内对各物质的标准溶液进行全扫描，得到10种防霉剂的最大吸收波长分别为：氨基苯磺酰胺258 nm，苯并咪唑266 nm，BIT 318 nm，MBT 323 nm，IPBC 230 nm，PCMC 280 nm，水杨酰苯胺268 nm，OPP 284 nm，TCMTB 281 nm，OIT 278 nm。

综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响，在减少干扰、保证有较大灵敏度的前提下，最终选取275 nm作为氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、PCMC、水杨酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT的定量检测波长，320 nm 作为BIT和MBT的定量检测波长，230 nm作为IPBC的定量检测波长。

2.1.2色谱柱的选择测定防霉剂常用的液相色谱柱为C18柱，因此本实验对UPLC 系统常用的 BEH C18(2.1 mm×500 mm，1.7 μm)和HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱进行了考察。结果显示，两种色谱柱均存在难分离的物质对(TCMTB与OPP)，在 BEH C18柱上目标物的峰形较宽。调节梯度洗脱程序后，10种防霉剂在 HSS T3柱上得到很好的分离；但在BEH C18柱上，仅目标物质的保留时间有轻微变化，峰形无明显改善，TCMTB与OPP的色谱峰仍无法分开。这是由于HSS T3柱的理论塔板数高于BEH C18柱，因而峰形较尖锐；此外，HSS T3的填料是以高纯硅胶作为载体，其碳载量为11%，小于BEH C18(碳载量为17%)，有利于极性较大的化合物分析，因而可将TCMTB与OPP分开。因此本文选用HSS T3柱作进一步的色谱条件优化。

图1　10种目标物混合标准溶液(50 mg/L)的色谱图(λ=275 nm)Fig.1　Chromatogram of 10 analytes mixed standard solution(50 mg/L，λ=275 nm) the number of compounds denoted is the same as that in Table 1

图2　不同提取溶剂对皮革样品中10种待测物的提取回收率Fig.2　Recoveries of 10 analytes in leather samples extracted by different kinds of solvent

2.1.3梯度洗脱条件的优化由于本文考察的10种物质极性范围较宽，采用等度洗脱程序无法将其完全分离，为提高极性相似化合物的分离度，改善化合物的峰形，比较了不同梯度洗脱程序对10种目标物质的洗脱效果。当初始有机相比例为20%时，苯并咪唑的色谱峰与杂质峰重合，OPP与TCMTB的色谱峰重叠；当初始有机相比例为10%时，缩短有机相比例由50%变为90%的时间，苯并咪唑色谱峰与杂质峰分开，且峰形较好，但OPP和TCMTB的色谱峰重叠，10种待测物质不能完全分开。采用“1.4”所示的梯度洗脱程序时，10种目标物质得到较好的分离，且响应较高。

在选定的仪器条件下，10种目标物质混合标准溶液的UPLC色谱图如图1所示，10种化合物获得了较好的分离。

图3　甲醇对皮革样品(A,B)与标准品(C)的提取对比Fig.3　Extraction effect of different leather matrix(A,B) and standard(C) by methanol the number of compounds denoted is the same as that in Table 1

2.2提取溶剂的优化

本研究的10种防霉剂均微溶或难溶于水，易溶于有机溶剂，因此比较了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯4种溶剂对加标皮革样品中目标物的提取效果，其中BIT的添加浓度为10 mg/kg，其余9种防霉剂的添加浓度为25 mg/kg，回收率结果见图2。结果表明，因皮革中脂肪和染料的含量较高，用丙酮等弱极性有机溶剂提取，会同时萃取出皮革样品中的脂肪及染料，干扰目标物的提取，导致部分目标物质的提取回收率偏低；用乙酸乙酯作提取溶剂时，基质干扰较严重；用甲醇和乙腈提取时，脂肪和染料的溶解度较小，萃取液中的杂质较少，其中以乙腈萃取液中的杂质干扰最少，但与甲醇相比，差别不明显，且甲醇提取液中杂质与目标物的色谱峰分离度超过1.5，达到基线分离，不影响目标物的定性和定量。进一步比较两种提取溶剂对目标物的提取回收率(图2)，甲醇的提取效率整体较好，对各目标物的提取率较为均衡，萃取效果最佳。

采用甲醇对两份阳性牛皮革样品进行提取，色谱图见图3。由图可知，杂质出峰时间集中在5～8 min和25～30 min，杂质的含量和种类因皮革的不同而不同，但对目标物均不产生干扰。综合以上因素，选取甲醇为提取溶剂。

2.3线性关系与检出限

按“1.2”方法配制10种待测物系列混合标准工作液，其中氨基苯磺酰胺、MBT和水杨酰苯胺的浓度分别为1.5，15.0，50.0，100.0，200.0 mg/L，苯并咪唑、BIT、PCMC、OPP、TCMTB和OIT的浓度分别为3.0，10.0，50.0，100.0，200.0，300.0 mg/L，IPBC的浓度分别为75.0，100.0，200.0，300.0，500.0，1 000.0 mg/L。按优化的仪器条件进行检测，以各待测物的峰面积(y)对相应的质量浓度(x，mg/L)绘制标准曲线。以各待测物3倍信噪比(S/N=3)的响应值对应的浓度作为仪器的检出限(LOD)，在样品中添加混合标准溶液，于优化的实验条件下进行处理和测定，以10倍信噪比(S/N=10)计算方法的定量下限(MLOQ)。由表1可知，10种待测物在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均不小于0.999 3，LOD为0.5～25.0 mg/L，MLOQ为4.0～190.0 mg/kg。

表1　10种待测物的线性方程、相关系数、检出限及方法定量下限Table 1　Linear equations，correlation coefficients(r2)，detection limits (LODs) and method quantitation limits(MLOQs) of 10 analytes

2.4回收率与精密度

选取阴性皮革样品分别进行3个水平(MLOQ，2MLOQ，10MLOQ)的加标回收实验，6次平行实验的结果见表2。由表2可见，在加标浓度范围内，10种待测物的平均回收率为81.3%～104.9%，相对标准偏差(RSD，n=6)为4.7%～11.2%，说明该方法具有良好的回收率与精密度。

表2　回收率与精密度测定结果(n=6)Table 2　Determination results of recovery and precision(n=6)

(续表2)

CompoundSpiked(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Salicylanilide4.0,8.0,40.097.1,102.7,104.69.1,4.8,5.9OPP8.0,16.0,80.090.1,92.9,94.36.7,7.5,9.6TCMTB8.0,16.0,80.098.3,97.2,104.96.1,5.5,7.5OIT8.0,16.0,80.091.4,90.7,92.64.9,7.2,8.4

2.5实际样品的检测

采用本方法测定了购自市场的10个皮革样品。结果7个样品检出OPP，检出量为6.4～97.6 mg/kg；6个样品检出PCMC，检出量为17.4～131.5 mg/kg；3个样品检出OIT，检出量为10.6～126.7 mg/kg；其余防霉剂均未检出。

3　结　论

本文建立了超声萃取结合UPLC同时测定皮革中氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水杨酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT 10种防霉剂的方法。本方法准确、灵敏，具有良好的回收率和精密度，可为定性定量分析皮革中防霉剂提供一种准确有效的检测方法。

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Determination of 10 Kinds of Fungicides in Leather by Ultrasonic Extraction Combined with Ultrahigh Performance Liquid Chromatography

WU Yu-luan1,2*，WANG Li1,2，LUO Hai-ying1,2，XIAN Yan-ping1,2，DONG Hao1,2，WANG Bin1,2，HAN Wan-qing1,2

(1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou511447，China；2.National Center for Quality Supervision and Testing of Leather Product(Guangzhou)，Guangzhou511447，China)

A new method was established to determine 10 kinds of fungicides(including sulfanilamide，benzimidazole，BIT，MBT，IPBC，PCMC，salicylanilide，OPP，TCMTB，OIT) in leather samples by ultrasonic extraction combined with ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC).The leather samples were ultrasonically extracted with methanol，and separated with T3column，employing methanol and 0.1%(by volume) formic water as mobile phase by gradient elution．All of the samples were detected with diode-array detector.The 10 kinds of analytes presented favorable linearity in a certaim concentration range，with correlation coefficients(r2) not less than 0.999 3.The method quantitation limit(LOQ，S/N=10) of IPBC was 190.0 mg/kg，and the LOQs of other compounds were in the range of 4.0-8.0 mg/kg.The average recoveries(n=6) ranged from 81.3% to 104.9%，and the relative standard deviations (RSD，n=6) were in the range of 4.7%-11.2%.With the advantages of simple pre-treatment procedure and satisfactory separate effect，the developed method was suitable for the simultaneous determination of 10 kinds of fungicides in leather samples.

leather;fungicide; ultrasonic extraction;ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC)

2016-03-15；

2016-04-06

广东省质量技术监督局科技项目(2015PZ06)；广州市质量技术监督局科技项目(2015kj10)

吴玉銮，博士，教授级高级工程师，研究方向：色谱-质谱检测，Tel：020-82022303，E-mail：docwu@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.007

O657.72; TQ572.41

A

1004-4957(2016)09-1116-05