白藜芦醇抑制肝癌Smmc-7721细胞增殖及机制研究

李 璐， 王 璐， 陈光亮， 黄梅仙， 宋 睿， 魏 强

(安徽中医药大学 中西医结合临床学院生物化学与分子生物学教研室安徽省中医药科学院 中西医结合研究所，合肥 230012)



白藜芦醇抑制肝癌Smmc-7721细胞增殖及机制研究

李 璐， 王 璐， 陈光亮， 黄梅仙， 宋 睿， 魏 强

(安徽中医药大学 中西医结合临床学院生物化学与分子生物学教研室安徽省中医药科学院 中西医结合研究所，合肥 230012)

采用MTT法研究白藜芦醇对肝癌Smmc-7721细胞增殖的影响，并采用Western blotting法分析p-Erk1/2/Erk1/2、p-mTOR/mTOR和p-Akt/Akt蛋白水平。结果表明：白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞后，细胞活力受到明显抑制(P< 0.001)。80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24 h时，细胞的p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明显降低(P= 0.009)。且白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞72 h时，p-mTOR/mTOR蛋白水平明显提高，但p-Akt/Akt蛋白水平却无明显差异。白藜芦醇可通过Erk1/2信号途径抑制肝癌细胞增殖。同时，白藜芦醇可通过Akt非依赖的途径激活mTOR信号通路，提示白藜芦醇可调控肝癌Smmc-7721细胞的能量代谢。

肝癌；白藜芦醇；p-Erk1/2/Erk1/2；p-mTOR/mTOR；p-Akt/Akt；能量代谢

肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，癌症中病死率位于第二，疗效差，由于患者年龄、性别、免疫功能、肝脏状态、肿瘤分期等因素影响[1]，预后不佳，寻找有效的治疗药物尤为重要。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是从虎杖等植物中分离提取的一种多酚类化合物。虎杖作为我国传统的天然中草药，是《中国药典》《国家药品中药标准》等药典中所记载的保肝制剂类药的常见组成成分。而白藜芦醇作为虎杖中重要成分之一，现代药理学研究发现，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗癌[4-6]、抗心肌肥大[7]等作用。但其作用机理目前却不清楚。本文通过研究白藜芦醇对肝癌Smmc-7721细胞活力的影响及机理，旨在探寻白藜芦醇抗肝癌的有效靶点。

1　材料与方法

1．1材料

人肝癌Smmc-7721细胞(上海交通大学临床医学院提供)；白藜芦醇(购自sigma)；二甲亚砜、MTT、RIPA强裂解液、Bradford蛋白定量试剂盒(均购自碧云天生物技术研究所)；兔抗人p-Akt单克隆抗体(磷酸化位点Thr308)、兔抗人Akt单克隆抗体、兔抗人p-mTOR单克隆抗体(磷酸化位点Ser2448)、兔抗人mTOR单克隆抗体、兔抗人p-Erk1/2单克隆抗体(磷酸化位点Thr 202/Tyr 204)、兔抗人Erk1/2单克隆抗体、兔抗人β-actin和兔抗人β-Tublin(均购自Cell Signaling Technology)；羊抗兔荧光二抗(美国LI-COR公司提供)；RPMI 1640培养基(购自Gibco)；胎牛血清(购自Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌Smmc-7721细胞按常规培养于含12%胎牛血清的RPMI1640培养基中，5% CO2培养箱内培养，取生长对数期细胞进行后续实验。

1.2.2 药物处理 白藜芦醇溶解于二甲亚砜中，终浓度100 mM于4℃保存备用。分别以 5、10、20、40、80和100 μM白藜芦醇处理细胞，以0.1% 二甲亚砜作为溶媒对照组。

1.2.3 MTT实验 细胞以每孔5×103个密度接种于96孔板中，贴壁良好后，分别加入上述不同浓度的白藜芦醇处理，每个浓度设5个复孔，另设阴性对照组和溶媒对照组。于加药24 h、48 h和72 h后分别加20 μL MTT(终浓度5 mg/mL)，37℃继续培养4 h后，吸除上清，每孔加150 μL二甲亚砜显色，检测490 nm的吸光度值(D490 nm)表示为细胞活力。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 蛋白提取定量及Western blotting实验 细胞以80 μM白藜芦醇分别处理24、48和72 h后，用RIPA强裂解液抽提蛋白，并按Bradford法进行蛋白定量。另设阴性对照组和溶媒对照组。定量后的蛋白进行SDS凝胶电泳、转膜和封闭后，分别一抗4℃孵育过夜。其中p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、p-Erk1/2(1∶1000)、Erk1/2(1∶1000)。以β-actin或β-Tublin作为内参(1∶1000)。洗膜后，以荧光羊抗兔二抗(1∶10 000)于室温孵育1 h，洗膜3次后，于Odyssey双色红外荧光成像系统(美国LI-COR公司)扫描成像，Image J软件分析结果。实验重复3次，取平均值。

2　结果

2.1 MTT结果

如图1所示，白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24 h，仅100 μM处理组的细胞活力受到显著抑制(P=0.005)。但随着处理时间延长至48 h和72 h时，80 μM白藜芦醇也明显抑制肝癌Smmc-7721细胞活力(P< 0.001)。说明白藜芦醇对肝癌Smmc-7721细胞活力的抑制作用具有一定的剂量-时间依赖效应。但用较低浓度(< 80 μM)的白藜芦醇处理24、48和72 h，均未观察到显著的抑制作用。

图 1 白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24、48和72 h的结果Fig 1 Cell viability in Smmc-7721 cells treated with resveratrol for 24, 48 and 72 h

2.2 p-Akt/Akt蛋白水平变化

如图2所示，80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24、48和72 h，细胞p-Akt/Akt蛋白水平与空白对照组和溶媒对照组相比，均未出现明显差异。

图2 80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞 24、48和72 h p-Akt/Akt蛋白水平Fig 2 The protein level of p-Akt/Akt in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

图3 80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞 24 h、48 h和72 h p-mTOR/mTOR蛋白水平Fig 3 The protein level of p-mTOR/mTOR in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

2.3 p-mTOR/mTOR蛋白水平变化

如图3所示，80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24 h和48 h，细胞 p-mTOR/mTOR蛋白水平与空白对照组和溶媒对照组相比，未出现明显差异。但当处理72 h时，p-mTOR/mTOR蛋白水平则出现明显升高(P= 0.001)。

2.4 p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平变化

如图4所示，80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24 h，p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明显降低(P= 0.009)。而处理48 h和72 h时，p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平无明显差异。

图4 80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞 24、48和72 h p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平Fig 4 The protein level of p-Erk1/2/Erk1/2 in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

3 讨论

近年研究表明白藜芦醇可依靠其抗氧化性，突变作用，诱导第二相药代酶，传递抗炎作用，以及抑制环氧合酶和过氧代氢酶功能[8]等方式，在肿瘤的发生、发展及促进过程中都具有显著的抗肿瘤功效。Bishayee等对二乙亚硝胺诱导的肝癌动物模型研究发现，白藜芦醇可能通过上调Nrf2核转录因子介导的相关基因表达，从而促进肝癌细胞凋亡[9]。Xu等研究发现，白藜芦醇可通过下调miR-151 和FAK mRNA表达发挥抗肝癌Hep G2细胞增殖的作用，且具有剂量依赖效应[10]。这与本研究结果一致。本研究发现，白藜芦醇对肝癌Smmc-7721细胞活力具有显著的抑制作用，且具有一定的剂量-时间依赖效应。

虽然白藜芦醇的抗肝癌作用已经明确，但其作用机制却不清楚。本研究发现，80 μM白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞24 h，细胞p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明显降低。Erk1/2是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路家族的一员。大量研究表明，在许多恶性肿瘤细胞中，Erk的过度活化增加了肿瘤细胞的增殖[11]和侵袭能力，影响细胞分化，抑制细胞凋亡[12-13]。研究表明阻断Erk1/2信号通路可促进肿瘤细胞凋亡[14]。Seidman等以Erk抑制剂抑制Erk1/2活性后，能促进紫杉醇诱导的卵巢癌SKOV3细胞的凋亡[15]。本实验研究表明，白藜芦醇可能通过阻断Erk1/2信号通路而发挥抑制肿瘤细胞活力的作用。

本研究发现，白藜芦醇处理肝癌Smmc-7721细胞72 h时，细胞p-mTOR/mTOR水平会显著提高，但p-Akt/Akt水平却无显著变化。mTOR是一种保守的酪氨酸激酶，在调节细胞增殖、生长、存活、分裂、运动和血管生成中起着关键作用[16]。现代研究表明，mTOR信号途径磷酸化的途径有两条[17]：一条是PIK3/Akt/ mTOR途径；另一条是非依赖Akt途径，且此途径与细胞能量代谢相关。本研究结果显示，白藜芦醇可通过非Akt途径激活mTOR，提示白藜芦醇作用肝癌Smmc-7721细胞后，可调控细胞的能量代谢。

总之，本研究表明，白藜芦醇可通过阻断Erk1/2信号通路而发挥抑制肿瘤细胞活力的作用。此外，白藜芦醇也可通过mTOR信号通路调控肝癌细胞的能量代谢。但在白藜芦醇发挥抑制肝癌细胞的过程中，细胞能量代谢的调控扮演什么角色，目前还不清楚，有待进一步深入研究。

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The inhibitory effect of resveratrol in hepatocellular carcinoma Smmc-7721 cells

LI Lu, WANG Lu, CHEN Guang-liang, HUANG Mei-xian, SONG Rui, WEI Qiang

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui University of Chinese Medicine,Institute of Combined Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230012, China)

To investigate the inhibitory effect and mechanism of resveratrol in hepatocellular carcinoma cells, cell viabilities were detected by MTT assay and protein levels were detected by Western blotting. The results indicated that resveratrol significantly exhibited inhibitory effect in hepatocellular carcinoma Smmc-7721 cells. And the level of p-Erk1/2/Erk1/2 significantly decreased in cells treated with resveratrol. Furthermore, the level of p-mTOR/mTOR significantly increased in cells treated with resveratrol. But, there was no significant change in the level of p-Akt/Akt. The data suggest that resveratrol exhibits the inhibitory effect via Erk1/2 pathway in hepatocellular carcinoma cells. And resveratrol can regulate the energy metabolism via mTOR pathway in hepatocellular carcinoma cells.

liver neoplasms; resveratrol; p-Erk1/2/Erk1/2； p-mTOR/mTOR； p-Akt/Akt； energy metabolism

2015-12-16；

2015-12-23

安徽省自然科学基金项目(1408085QH171)；安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2012Z216)；安徽中医药大学青年科研基金项目(2012qn06)；安徽中医药大学“安科生物大学生药苑之星”科研项目(20140104)

李璐，博士，副教授，主要从事抗肿瘤药理方面的研究，E-mail：deerlyee@hotmail.com

R966;R735.7

A

2095-1736(2016)05-0067-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.067