曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型小鼠的调节作用

董 慧， 王力东， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李荣华

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)



曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型小鼠的调节作用

董 慧， 王力东， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李荣华

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)

探究曼氏无针乌贼墨汁黑色素(Melanin fromSepiellaMaindroniInk,MSMI)对免疫低下小鼠的调节作用。SPF级ICR小鼠60只，随机平均分为6组，其中5组(模型组，阳性对照组，墨汁黑色素低、中，高剂量组)用氢化可的松造免疫低下模型，另外一组为空白对照组。连续灌胃不同剂量的黑色素10 d，从免疫学水平评价曼氏无针乌贼墨汁黑色素的免疫调节效应。结果表明，曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)能显著提高免疫低下小鼠的肝、脾指数(P<0.01,P<0.01)，而且不同灌胃剂量的黑色素对巨噬细胞的吞噬率和吞噬能力的提高也有显著差异(P<0.05,P<0.01)，曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)也能够通过调节抗氧化体系的稳态增强机体免疫力。可见曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)可以增强免疫器官的调节能力，尤以高剂量组最为显著。

曼氏无针乌贼墨汁；黑色素；巨噬细胞；免疫调节

自然界中的黑色素分为褐色素和真黑色素两大类，即由苯并噻嗪和苯丙噻唑聚合形成褐色素，而上述两种物质的基本结构单元(5,6-二羟基吲哚和5,6-二羟基-2-吲哚羧酸)形成真黑色素[1]。其中乌贼墨汁、乌骨鸡和乌骨绵羊中的黑色素都属于真黑色素，黑色素对光的吸收具有广谱性，所以能够吸收可见光和紫外光辐射的活性物质。近年在陆生动、植物和工程菌、粒毛盘菌，以及其他新型菌株(AspergillusbridgeriICTF-201)提取物黑色素的研究中发现黑色素还具有重要的生理功能，如氧化还原性、电导性、螯合金属离子、清除体内自由基的抗氧化功能，以及抗菌和抗病毒活性等功能[2-7]，但目前从海洋生物中提取天然黑色素并对其生理活性的研究还鲜有报道。

曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni，Rochebrune)隶属软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属，近海广布性种，俗名墨鱼、海猫等[8]。乌贼墨是用来防御敌害由其墨囊喷出的，在加工过程中，墨囊多作为加工废弃物处理，容易污染环境，经分析发现乌贼墨汁是由黑色颗粒构成的悬浊液。在对乌贼墨研究过程中发现，主要发挥调节机体免疫、抗菌、抗病毒、促进机体造血、凝血和抗肿瘤功能的主要活性物质是多糖[9-13]。关于乌贼墨汁黑色素的研究多为结构、理化性质，它的生物学活性却鲜被报道。

实验室前期用曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对D-半乳糖所致的衰老模型起到很好的抗氧化作用[14]。本文以颈背部皮下注射氢化可的松造成的免疫低下小鼠为实验对象，灌胃不同剂量的MSMI，分别测定与免疫相关的脏器指数、氧化酶活性和腹腔巨噬细胞吞噬能力[15-16]，评价MSMI免疫调节作用，为开发乌贼墨汁黑色素药用价值奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni,Rochebrune)墨囊，由浙江省舟山市海水养殖厂提供，-20℃冻藏，使用时于0℃解冻。60只ICR小鼠，雌雄各半，由宁波大学动物房提供(合格证号0023472)。

1.1.2试剂与仪器2%红细胞悬液；碱性蛋白酶(solarbia公司)；氢化可的松(Hydrocortisone HC)；盐酸左旋咪唑；考马斯亮蓝试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，以上生化指标试剂盒购自南京建成生物工程研究所。SPECTRA max190酶标仪(Molecular Decices公司)；XSP-2C型生物显微镜(上海恒勤仪器设备有限公司)；T-18Basic 内切式匀浆机(IKA公司)；FreeZone4.5台式冷冻干燥机(Labconco公司)。

1.2方法

1.2.1 2%红细胞悬液的制备 无菌条件下抽取动物心脏血，在EP管中加入5倍体积的血液抗凝剂，1000 r/min,10 min离心至上清液透亮，用生理盐水洗涤3次，弃去细胞表面层，制得哺乳动物红细胞。等体积加入生理盐水，配成体积比为2%的红细胞悬液备用。

1.2.2曼氏无针乌贼墨汁黑色素的制备 参考酶法提取黑色素实验[17]以及优化本实验室已有的方案[18]，采用酶解法提纯所得高浓度MSMI，主要的工艺流程如下：挤压冲洗100只乌贼墨囊获得墨汁，三层纱布过滤防止混入破碎组织，重复2次离心(8000 r/min，10 min)，冷冻干燥得黑色素粗品，用碱性蛋白酶精提黑色素，2%的粗品黑色素和1.5%的碱性蛋白酶在碱性(pH 10～10.5)，温度为50℃酶解4～5 h，获得的酶解产物离心6次(6000 r/min，10 min)，冷冻干燥，获得高纯度曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)，4℃冰箱保存备用。

1.2.3小鼠免疫低下模型的建立和MSMI的灌胃

60只ICR品系小鼠，分为空白对照组，模型对照组，阳性对照组，曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)低、中组，高剂量组，每组10 只，雌雄各半。除空白对照组颈部皮下注射生理盐水外，其余组注射等量的HC[ 30 mg/(kg·d)]，一天一次，连续3 d，建立小鼠免疫低下模型。阳性对照组小鼠灌胃盐酸左旋咪唑[20 mg/(kg·d)]，低、中、高3组分别灌胃25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d) 的MSMI，一天一次，连续10 d。实验过程中小鼠按照日常饲养管理，并保证每日给药时间相同。

1.2.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定 最后一次给药后，供食停止，水正常提供12 h，每只小鼠进行腹腔注射自制的2%红细胞悬液，30 min后脱臼处死小鼠，收集腹腔巨噬细胞，用丙酮和甲醛(1∶1)固定，Giemsa-磷酸缓冲液染色，油镜计数，计算吞噬百分率和吞噬指数[15]。

1.2.5小鼠脾、肝/体重比测定 同1.2.4处死的同一批小鼠，仔细剥离脾、肝，称重，计算脾、肝/体重。

1.2.6小鼠免疫器官相关免疫生化指标的测定称肝、脾重量，按重量(g)∶体积(mL)为1∶9的比例生理盐水，冰上匀浆，离心(2500 r/min,10 min)，取上清液备用。参照各试剂说明书测定匀浆上清液过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)的含量。

1.2.7 统计学分析 所得结果用平均值±标准差表示，数据分析采用SPSS 19.0软件统计处理。组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05 为具有统计学显著差异，P<0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)能显著促进免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力(表1)。结果表明：与正常组相比，模型组的吞噬率和吞噬指数显著降低(P<0.01,P<0.01)，与模型组相比，MSMI 3个剂量组吞噬率分别提高了43.31%、29.75%和16.71%；吞噬指数也有显著提升，以高剂量组效果最显著(P<0.01,P<0.01)。

2.2 曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对小鼠肝、脾指数的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型组小鼠肝、脾/体重比值显著下降(P<0.01，P<0.01)；与模型对照组相比，各剂量组小鼠肝、脾脏/体重比值均有显著提高(P<0.01,P<0.01)，其中高剂量组在肝、脾器官中均表现为极显著差异(P<0.01,P<0.01)。

2.3 曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对免疫低下小鼠免疫器官相关免疫指标的影响

2.3.1 曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对小鼠肝、脾SOD、GSH-Px含量的影响结果表明(表3)，模型组小鼠与正常组相比，肝、脾中SOD、GSH-Px值降低。黑色素组与模型组相比，黑色素3个剂量组小鼠肝脏SOD含量分别升高了35.75%、20.02%和19.84%，脾脏中SOD含量分别升高了42.30%、29.14%、18.59%；模型组小鼠的肝、脾GSH-Px值与正常组比较， GSH-Px值降低了13.07%、17.25%；灌胃3个不同剂量黑色素组与模型组相比，黑色素组小鼠肝脏GSH-Px的含量分别升高了21.27%、16.55%和11.9%，脾脏GSH-Px的含量分别升高了21.77%、17.06%和18.32%。

表1 曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型 小鼠单核-巨噬墨汁细胞吞噬能力的影响Table 1 Effects of melon on mononuclear macrophages′ function in hypoimmune mice

#：P<0.05，##：P<0.01，与正常对照组相比；*：P<0.05，**：P<0.01，与模型对照组相比。下同

表2 曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型 小鼠肝/体重、脾/体重比值影响Table 2 The effect of MSMI on organ index in hypoimmune mice ±s)

2.3.2 曼氏无针乌贼墨汁黑色素对小鼠体内CAT、MDA含量的影响表4显示模型组小鼠肝、脾CAT值与正常组相比，CAT值升高(P<0.01,P<0.01)；而灌胃3个不同剂量的黑色素组与模型组相比，低剂量组肝中CAT显著升高(P<0.05)，脾中无显著差异，而高、中剂量组肝、脾中CAT极显著升高(P<0.01,P<0.01)。免疫低下模型组肝、脾MDA值与正常组相比，均显著升高(P<0.01,P<0.01)；灌胃黑色素低剂量组的MDA含量与模型组相比，肝组织中显著降低(P<0.05)，脾中MDA表现不显著，而高、中剂量组小鼠肝、脾中MDA的含量差异极显著(P<0.01,P<0.01)。

表3 曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型小鼠肝、脾组织相关生化酶活性SOD、GSH-PX的影响Table 3 Effects of Me-I on liver and spleen SOD and GSH-PX in hypoimmune mice

表4 曼氏无针乌贼墨汁黑色素对免疫低下模型小鼠肝、脾相关生化酶活性CAT、MDA的影响Table 4 Effects of Me-I on liver and spleen CAT and MDA in hypoimmune mice

3 讨论

脾脏和肝脏是调节机体免疫的器官，肝、脾/体重比值也是用来衡量机体免疫能力的指标[19]。在非特异性免疫中，单核巨噬细胞可迅速将进入体内的细菌、异物等抗原性物质清除，因而巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数的大小可以反映其吞噬功能的强弱[20-22]。本实验中，免疫低下模型组与正常组相比，小鼠肝、脾/体重比值、巨噬细胞的吞噬能力都显著下降，这些结果与以前研究报道的一致[23-24]，说明小鼠免疫低下模型建立成功。阳性对照组(盐酸左旋咪唑)与模型组相比，小鼠肝、脾脏器指数、巨噬细胞的吞噬能力都显著升高，说明盐酸左旋咪唑有明显的免疫调节作用，适合作为阳性对照。3组不同剂量黑色素组与模型组相比，小鼠肝、脾脏器指数、巨噬细胞的吞噬能力都显著升高且和黑色素剂量有成正比的趋势，表明MSMI能对抗氢化可的松引起的脾、肝萎缩，因而肝、脾/体重比值显著升高，相对表明黑色素能增强机体免疫力。另外，MSMI能对抗氢化可的松引起的小鼠巨噬细胞的吞噬能力降低，说明MSMI还能促进小鼠非特异性免疫。

一套完整的抗氧化防御体系，使机体内自由基持续维持一种动态平衡状态[25-26]，是维持机体正常的必要条件。但当抗氧化系统遭到破坏时，就会产生过量的脂质过氧化物，脂质过氧化物含量能够反映出体内脂质过氧化程度，另一方面它能够间接地反映出细胞受损伤的程度。作为抗氧化防御体系之一的SOD与其他抗氧化酶如CAT、GSH-Px联合作用能起到清除超氧阴离子自由基和修复体内氧化性损伤作用的功能[26]。在本实验中，腹腔注射氢化可的松后，小鼠体内的自由基平衡状态被打破，即SOD、CAT、GSH-Px的活性降低，从而导致体内产生过量的MDA等脂质过氧化物，灌胃3个不同剂量的黑色素后小鼠脾、肝中MDA含量显著下降，而SOD、GSH-Px、CAT活性都有所上升，这与先前报道的抗氧化防御机制清除体内过量自由基报道一致[14,27-28]，也与我们建立的阳性对照组的结果相一致。说明，曼氏无针乌贼墨汁黑色素(MSMI)对免疫低下机体产生的氧化损伤有一定的修复作用且黑色素剂量越大免疫调节能力越强。

综上所述，曼氏无针乌贼墨汁黑色素能够显著改善免疫低下模型小鼠的免疫功能，提高免疫器官肝脏、脾脏器官指数，加强腹腔巨噬细胞吞噬率，同时显著增强了肝脏等器官中各种免疫生化相关酶的活性，无论是在特异性免疫还是非特异性免疫机制方面都有一定的调节作用。因此，本研究为进一步探究曼氏无针乌贼墨汁黑色素药用价值提供了理论依据。

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Immunomodulatory effects of melanin from Sepiella Maindroni ink on hypoimmune mice

DONG Hui, WANG Li-dong, WANG Chun-lin, SONG Wei-wei, MU Chang-kao, LI Rong-hua

( School of Marine Science， Ningbo University Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, the immunomodulatory effects of MSMI (melanin fromSepiellamaindroniink) on hypoimmune mice induced by Hydrocortisone(HYD) was investigated . ICR mice were selected as animal mode, which were randomly divided into six groups, including control groups, hypoimmune mice, positive control groups(Levamisole Hydrochloride), and MSMI treated groups of low, medium and high dosage. Except for the control group, all the other groups were treated with Hydrocortisone by subcutaneous injection. After a trial period of 10 days, the liver and spleen indexes and phagocytic capacity of macrophages were analyzed, and which were found to be significantly enhanced in the treated groups(P<0.01，P<0.01),(P<0.05,P<0.01) as compared to that in the control group. Antioxidant enzyme activities were also measured and they significantly increased compared to the hypoimmune mice group. However, lipid peroxidation assayed as melondialdehyde (MDA) reduced significantly in the treated groups compared to that in the control. It is suggested that MSMI can promote immune function of immune-depressed mice.

SepiellaMaindroniInk; Melanin; macrophages; immune-depressed mice

2015-12-10；

2016-01-18

国家自然科学基金项目(41206114，41176124)；教育部博士点基金(20103305110003);浙江省自然科学基金项目(LQ12C19002)；浙江省教育厅项目(Y201224605)；浙江省自然科学基金重点项目(Z3110482)；浙江省公益性项目(ZX2013000403)；大学生创新孵化项目(2016R405096)

董慧，硕士研究生，主要从事海洋生物学研究，E-mail:18766566035@163.com

宋微微，讲师，主要从事曼氏无针乌贼养殖及其副产品开发, E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

Q959.9； R285.5

A

2095-1736(2016)05-0027-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.027