D-半乳糖致糖基化小鼠模型的评价

冀雄飞， 王力东， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李荣华

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室浙江海洋高效健康水产养殖协同创新中心， 宁波 315211)



D-半乳糖致糖基化小鼠模型的评价

冀雄飞， 王力东， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李荣华

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室浙江海洋高效健康水产养殖协同创新中心， 宁波 315211)

采用200 mg·kg-1·d-1的D-半乳糖诱导小鼠45 d建立糖基化模型，通过新物体识别检测模型组与正常对照组小鼠行为学差异，进一步利用酶联免疫法检测小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、皮肤、肌肉和血清中的糖基化末端产物和相关受体的表达量(AGEs、RAGE、sRAGE和esRAGE)，分析该模型中4种指标的变化情况。结果表明模型组小鼠的辨别指数显著低于空白组(P<0.01)，模型组小鼠各组织器官中的糖基化末端产物和相关受体的表达量显著高于空白组(P<0.01)；D-半乳糖慢性处理45 d后的小鼠从行为上有一定的迟缓，同时在对各个不同组织器官的生理指标的检测中发现机体处于高糖基化状态，可用于研究AGEs及其受体的发病机理和药物治疗作用途径，并且可以选用多个组织器官作为实验靶点。旨在为颈背部皮下注射D-半乳糖致糖基化小鼠模型提供理论依据。

D-半乳糖；糖基化模型；AGEs；RAGE；sRAGE；esRAGE

晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)是指在非酶条件下，还原糖与蛋白质等一些有机大分子物质的游离氨基端反应形成不可逆的、形式多样的聚合物。随着年龄的增加，AGEs会不断在体内积累，对机体造成损伤或导致某些疾病的发生。AGEs 导致机体疾病或损伤的途径有多种，除了与蛋白质和脂质的直接作用，导致机体病变外，还通过与其细胞表面的晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products， RAGE)相互结合，激活细胞信号传导通路，从而干扰细胞功能，间接引发一系列生物学效应，对机体造成损害[1]；也可与一些游离的不具有激活信号转导功能的RAGE异构体，如可溶性晚期糖基化终末产物受体(soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE)、内源性分泌型晚期糖基化终末产物受体(endogenous secretory receptor for advanced glycation end products，esRAGE)等结合，使其无法与RAGE结合，以减少对机体的威胁。

近几年研究发现AGEs及其受体与肝病、肾病[3]、心血管疾病[4]、动脉粥样硬化[5]、阿尔茨海默病[6-7]、肿瘤、骨质疏松、慢性阻塞性肺疾病等密切相关，并在多种疾病中有举足轻重的作用。目前有关糖基化的研究，大多建立在某种疾病动物模型的基础上，把AGEs及其某些受体的水平变化与某些疾病联系到一起，例如：衰老模型、糖尿病模型等，但还没有一个公认的用来研究处于高糖基化状态下的动物模型。糖基化动物模型是揭示糖基化致病和药物治疗机制的实验工具。随着非酶糖基化研究的深入，简单、可靠的糖基化模型成为热点。

D-半乳糖是目前用来建立亚急性衰老模型的工具药，该模型被广泛应用于药物抗衰老的研究之中。D-半乳糖作为一种还原性的醛糖可通过非酶促途径和多元醇途径增强体内糖基化反应，产生大量的AGEs。同时，D-半乳糖长期处理小鼠，致使其血糖水平升高，体内的醛糖还原酶活性增强，加速AGEs的合成，造成AGEs的蓄积。所以颈背部注射D-半乳糖可以使小鼠处于高糖基化状态。

实验采用D-半乳糖诱导糖基化模型小鼠，以糖基化过程的主要产物AGEs以及多种产物受体(RAGE、sRAGE、esRAGE)作为该模型的评价指标，为用D-半乳糖建立糖基化模型进一步提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验动物

6周龄ICR雄性小鼠(SPF)20只，由北京花阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京) 2014-0004。

1.1.2药品与仪器

D-半乳糖(上海伯奥生物科技有限公司)；晚期糖基化终末产物(AGEs)酶联免疫试剂盒、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)酶联免疫试剂盒、可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)酶联免疫试剂盒、内源性分泌型晚期糖基化终末产物受体(esRAGE)酶联免疫试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)；离心机(Eppendorf 公司)；酶标仪(Molecular 公司)；T-18Basic内切式匀浆机(IKA公司)。

1.2模型的建立

将健康ICR小鼠，随机平均分成2组。模型组颈部皮下注射半乳糖200 mg·kg-1·d-1，对照组颈部皮下注射等量生理盐水，连续给药45 d后处死，建立D-半乳糖致糖基化模型。

1.3新物体识别试验检测方法

造模40 d后，进行试验。测试在白色塑料盒(60 cm×60 cm×40 cm)中进行，3个物体分别为A、B、C，其中A、B为大小形状完全相同的黑色长方形物体(5cm×5cm×6cm)，C为白色的正三角锥体(5cm×6cm)。测试第1天为适应期，每只小鼠需在盒子内自由活动，适应5 min，盒中不放任何物体。测试第2天进入熟悉期，物体A、B分别放置在盒子相对的两侧，距离盒壁10 cm，小鼠在两物体中间轻轻放下，观察并记录5 min内小鼠对每个物体的探索时间(以鼠嘴凑近物体约2cm范围内计时，鼠爬在玩具上玩或者只是在物体附近走则不能计入)，然后将动物放回鼠笼。测试第3天进入识别期，识别期与熟悉期步骤一样，将物体B换成物体C。鼠的物体识别能力以第3天新旧物体的探索时间而计算的分辨指数(discrimination index，DI)来评价。

分辨指数计算公式为：DI(%)=(N-F)/(N+F)×100%，式中N为小鼠在识别期探索新物体C所用的时间，F为探索旧物体A所用的时间。

1.4AGEs、RAGE、sRAGE和esRAGE的测定及方法

本实验分别采用AGEs ELISA剂盒、RAGE ELISA试剂盒、RAGE ELISA试剂盒、sRAGE ELISA试剂盒检测4种糖基化指标(上海雅吉生物科技有限公司)，检测范围为30～800pg/mL，3.0～120pg/mL，1.0～50 pg/mL和1～40 pg/mL。结果分别以每毫克组织或每毫升血清中AGEs、RAGE、sRAGE、esRAGE含量来表示，即pg/mg。给药结束后，小鼠眼眶取血，3000 r/min离心5 min，取血清低温保存。断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉和皮肤，用生理盐水将各组织制成组织匀浆并离心，取上清液待测。指标检测按相应试剂盒说明书操作。

1.5统计学分析

2　结果

2.1新物体识别能力检测

新物体识别实验结果显示空白对照组小鼠的分辨指数较模型组显著增高(P< 0.01)，见图1。该差异证明模型组老鼠的物体识别记忆能力较空白组低下显著，从行为观察来看，小鼠出现明显的物体识别障碍。

2.2糖基化模型中小鼠各组织AGEs及其受体的水平变化

2.2.1D-半乳糖对小鼠各组织器官中AGEs的变化

D-半乳糖处理小鼠45 d后，模型组小鼠各组织器官中AGEs的水平均显著高于空白组(P<0.01)，见表1。表明颈背部注射D-半乳糖可以显著地提高小鼠体内各组织器官中AGEs的水平，致使AGEs在小鼠体内各部位快速积累，使其快速进入高糖基化状态。

图1 实验各组的分辨指数比较Fig 1 DI comparison of experimental groups表1 D-半乳糖对小鼠各组织器官中AGEs的影响Table 1 Effects of D-galactose on the AGEs in tissuepg/mg

与空白组比较，*：P< 0.05，**：P< 0.01；下同2.2.2D-半乳糖对小鼠各小鼠各组织中RAGE的变化

D-半乳糖处理小鼠45 d后，模型组小鼠各组织器官中的RAGE的水平均显著高于空白组(P<0.01)，见表2。说明颈背部注射D-半乳糖也会导致小鼠体内各部位RAGE水平的显著升高，可能是由于AGEs水平的显著升高，激活了RAGE的表达通路，使其大量表达，水平显著升高，这也说明受体RAGE的水平与AGEs的水平呈正相关。

2.2.3D-半乳糖对小鼠各组织中sRAGE的变化

D-半乳糖处理小鼠45 d后，模型组小鼠各组织器官中sRAGE的水平均显著高于空白组(P<0.01)，见表3。说明颈背部注射D-半乳糖也会导致小鼠体内各部位sRAGE水平的显著升高，sRAGE的水平与AGEs的水平呈正相关。sRAGE是RAGE的异构体，随着RAGE的增加，机体可能通过增加sRAGE的表达拮抗RAGE介导的病理过程。

2.2.4D-半乳糖对小鼠各组织中esRAGE的变化

D-半乳糖处理小鼠45 d后，模型组小鼠各组织器官中RAGE的水平均显著高于空白组(P<0.01)，见表 4。表明颈背部注射D-半乳糖也会导致小鼠体内各部位esRAGE水平的显著升高，esRAGE的水平与AGEs的水平呈正相关。其原因可能是esRAGE是由RAGE的RNA选择性剪切而成，随着AGEs水平的升高，RAGE的表达量增加，致使esRAGE的表达量升高；也可能由于RAGE水平的升高，为了拮抗RAGE介导的病理生理过程，机体增加esRAGE的表达。

3　讨论

正常情况下，高水平的AGEs需要机体长期的积蓄才能形成，但当机体长期处于高血糖或者某些疾病状态下时，也会导致机体AGEs的水平显著升高[12]。D-半乳糖是一种立体结构的特异性D型糖类，能够增加多元醇通路中的首要限速酶(醛糖还原酶)的活性，加快糖醇-山梨醇类物质转化为果糖，果糖经过磷酸化、水解、重组、脱氢、交联后，形成不可逆的AGEs[11]，所以采用颈背部皮下注射D-半乳糖处理小鼠可以快速升高机体内的AGEs水平，迅速构建糖基化模型。AGEs作为糖基化过程的终末产物，能直接反映出体内糖基化水平[13]。

RAGE、sRAGE和esRAGE是AGEs的3种常见受体，并且互为异构体。RAGE为多配体的细胞表面免疫球蛋白超家族受体成员之一，与AGEs结合后，激活NF-κB，导致多种细胞因子、炎症因子、生长因子表达增加，对机体造成影响，与糖尿病[1]、心肌细胞损伤[14]、炎症[15-16]等密切相关。esRAGE是由细胞膜上RAGE 直接分泌到细胞外的一种剪切异形体，因其缺少信号转导功能，故与AGEs结合后，无法激活信号途径，从而阻断AGEs-RAGE通路对组织损伤作用[17]。sRAGE是esRAGE与基质金属蛋白酶剪切细胞膜表面的RAGE后释放到血液中的游离RAGE的总称，同样不具有信号转导功能，可以降低AGEs-RAGE通路对组织的损伤，并且与AGEs结合后，可以抑制AGEs的蛋白交联功能，抑制动脉粥样硬化斑块的发展[18]，缓解心室肥厚硬化[19]，对心力衰竭患者心脏功能有一定的保护作用[20]。3种受体都可直接与AGEs结合，对机体各组织产生作用，且实验证明小鼠体内各组织中3种受体的水平与各组织内的AGEs水平呈正相关，其水平高低也直接或间接地对机体有一定的影响，可以推测出3种受体的水平可能也反映出机体的糖基化水平。

本实验采用颈背部皮下注射D-半乳糖的方法，使模型小鼠在45 d内各组织器官中的AGEs及其受体水平显著高于空白对照组(P<0.01)，使其处于高糖基化状态，这符合自然衰老的行为学和糖基化产物水平的变化规律。本实验在前人[11]研究的基础上，以AGEs及其受体作为模型的新检测指标，为验证模型建立的成功提供理论依据。新物体识别实验证明，高糖基化状态下的小鼠其认知能力受到影响，这可能是由于糖基化在脑部的蓄积对小鼠脑部功能造成一定的损坏。实验证明此动物模型可以作为研究AGEs及其受体的发病机理和药物治疗作用途径的动物模型，并且可将小白鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾、皮肤、血清以及肌肉等各组织器官作为靶点进行研究。

[1]李平静, 李 雷, 杨荣礼. 晚期糖基化终产物受体、可溶性晚期糖基化终产物受体与2型糖尿病心血管并发症的关系[J]. 医学综述, 2015, 21(15): 2783-2786.

[2]蔡晓波, 范建高. 糖基化终末产物与肝病[J]. 国际消化病杂志, 2006, 26(1): 8-10.

[3]邓义斌, 陈香美, 叶一舟, 等. 糖基化终末产物对肾小球系膜细胞表达纤溶酶原激活物抑制物1的影响[J]. 中华医学杂志, 1997, 77(9):672-675.

[4]刘军锋, 孔美娟, 贾克刚. 晚期糖基化终产物与冠心病发病机制的研究进展[J]. 检验医学, 2014, 29(1):76-80.

[5]CIPOLLONE F, IEZZI A, FAZIA M, et al. Thereceptor RAGE as a progression factor amplifying arachidonate-dependent inflam-matory and proteolytic response in human atherosclerotic plaques: role ofglycemiccontrol[J]. Circulation, 2003, 108(9): 1070-1077.

[6]TAKEDA A, YASUDA T, MIYATA T, et al. Immunohistochemical study of advanced glycation end products in aging and Alzheimer′s disease brain[J]. Neuroscience Letters, 1996, 221(1):17-20.

[7]HORIE K, MIYATA T, YASUDA T, et al. Immunohistochemical localization of advanced glycation end products, pentosidine, and carboxymethyllysine in lipofuscin pigments of alzheimer′s disease and aged neurons[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1997, 236(2):327-332.

[8]冯华国, 鲁 灵, 吴传新. 晚期糖基化终末产物受体及其配体的肿瘤生物学效应[J]. 中国老年学杂志, 2012, 32(21): 4831-4833.

[9]邹玉婷, 沈建国. 晚期糖基化终末产物与骨质疏松症[J]. 国外医学(老年医学分册), 2008, 29(1): 12-15.

[10]雷 超, 胡占升. 慢性阻塞性肺疾病患者血浆晚期糖基化终末产物和可溶性糖基化终末产物受体浓度变化及其临床意义[J]. 中国全科医学, 2014, 17(8): 875-879.

[11]张世平, 谭海荣, 潘竟锵, 等. D-半乳糖致蛋白质糖基化动物模型的建立[J]. 基础医学与临床, 2006, 26(1):92-95.

[12]PEPPA M, URIBARRI J, VLASSARA H. The role of advanced glycation end products in the development of atherosclerosis[J]. Curr Diab Rep, 2004, 4(1):31-36.

[13]张世平, 方文娟, 吕俊华, 等. 葛根素抑制D-半乳糖致大鼠蛋白糖基化的实验研究[J]. 中药材, 2006, 29(3): 266-269.

[14]PETROVA R, YAMAMOTO Y, MURAKI K, et al. Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2002, 34(10):1425-1431.

[15]LILIENSIEK B, WEIGAND M A, BIERHAUS A, et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE) regulates sepsis but not the adaptive immune response[J]. Journal of Clinical Investigation, 2004, 113(11):1641-1650.

[16]BASTA G, SCHMIDT A M, DE CATERINA R. Advanced glycation end products and vascular inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes[J]. Cardiovascular Research, 2004, 63(4):582-592.

[17]KOYAMA H, YAMAMOTO H, NISHIZAWA Y. Endogenous Secretory RAGE as a Novel Biomarker for Metabolic Syndrome and Cardiovascular Diseases[J]. Biomarker Insights, 2007, 2: 331 339.

[18]BUCCIARELLI L G, WENDT T, QU W, et al. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E-null mice[J]. Circulation, 2002, 106(22):2827-2835.

[19]BAICU C, BRADSHAW A D, BOGGS J M, et al. Effects of inhibition of AGE-RAGE interaction in pressure-overload hypertrophy by treatment with sRAGE[J]. Journal of Cardiac Failure, 2008, 14(6):S15.

[20]孙利娜. 可溶性晚期糖基化终末产物受体与心力衰竭关系的临床研究[D]. 济南, 山东大学, 2014.

Establishment and evaluation of glycation model induced by D-galactose in mice

JI Xiong-fei, WANG Li-dong, WANG Chun-lin, SONG Wei-wei, MU Chang-kao, LI Rong-hua

(Key Laboratory of the Ministry of Education for Applied Marine Biotechnology, Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture, School of Marine Schences,Ningbo University, Ningbo315211, China)

To provide a theoretical basis of a new rat model of glycation, the mice of glycation were induced by injecting D-galactose (200 mg kg-1d-1) using injecting method for 45 days, which were measured the behavioral differences from model group to others and detected the index related to the glycation as AGEs, RAGE, sRAGE and esRAGE in variety organs of mice ( as brain, heart, liver, spleen, lung, kidney, skin, muscles and serum). The results showed that the DI of model group was decreased compared with that of the control group (P<0.01), though the number value of AGEs, RAGE, sRAGE and esRAGE of each tissues in mice were higher than that of control (P<0.01). This experiment investigated that it could make organism in a state of high glycosylation when they were injected by D-galactose (200 mg kg-1d-1) for 45 days. The model could be used in the study of the etiopathogenesis of AGEs which could discover the receptors and the pathway of pharmaceutical drug. And the index changing form in multiple tissues would give the researchers some suggestions in experimental targets using the model.

D-galactose； glycation model； AGEs； RAGE； sRAGE； esRAGE

2015-12-24；

2016-01-19

国家自然科学基金项目(41206114，41176124)；浙江省教育厅项目(Y201224605)；浙江省自然科学基金项目(LQ12C19002)；浙江省自然科学基金重点项目(Z3110482)；宁波大学“水产”浙江省重中之重开放基金

冀雄飞，硕士，研究方向为动物遗传育种研究，E-mail:jixiongfei821@163.com

宋微微，讲师，研究方向为水产动物遗传育种，E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

R392.8

A

2095-1736(2016)05-0063-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.063