法舒地尔联合罗格列酮对脂多糖诱导人冠状动脉内皮细胞MCP-1和VCAM-1表达的影响

李世云，巫相宏，黄文，王淳，马国添，闭奇

(广西医科大学附属第一医院，南宁 530021)



法舒地尔联合罗格列酮对脂多糖诱导人冠状动脉内皮细胞MCP-1和VCAM-1表达的影响

李世云，巫相宏，黄文，王淳，马国添，闭奇

(广西医科大学附属第一医院，南宁 530021)

目的观察法舒地尔联合罗格列酮对脂多糖(LPS)诱导的人冠状动脉(冠脉)内皮细胞(HCAEC)血管细胞黏附因子1(VCAM-1)、单核细胞趋化因子1(MCP-1)表达的影响。方法选用体外培养的第3～5代HECAC进行实验，将细胞分为空白对照组、LPS组(100 ng/mL LPS作用细胞)、法舒地尔组(10 nmol/L法舒地尔作用细胞)、罗格列酮组(10 μg/mL罗格列酮作用细胞)、LPS+法舒地尔组(先予10 nmol/L的法舒地尔干预细胞2 h后再给予100 ng/mL LPS共同干预22 h)、LPS+法舒地尔+罗格列酮组(先予10 nmol/L的法舒地尔和10 μg/mL罗格列酮干预细胞2 h后再给予浓度为100 ng/mL LPS共同干预22 h)，实时荧光定量PCR检测各组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA，ELISA法检测细胞上清液中可溶性VCAM-1、MCP-1蛋白。结果与空白对照组相比，LPS组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达高(P均<0.05)。与LPS组相比，LPS+法舒地尔组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达低(P均<0.05)。与LPS+法舒地尔组相比，LPS+法舒地尔+罗格列酮组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达低(P均<0.05)。结论法舒地尔联合罗格列酮可协同抑制LPS诱导的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表达，可能与两者共同抑制p38MAPK、NF-κB信号通路有关。

动脉粥样硬化；人冠状动脉内皮细胞;血管细胞黏附因子1;单核细胞趋化因子1

动脉内皮细胞炎症反应及可能存在的信号通路、炎症因子为目前动脉粥样硬化发病机制的研究热点。罗格列酮可通过p38MAPK信号通路抑制炎症反应，法舒地尔可通过下调p38MAPK和NF-κB的活性从而下调MCP-1的表达[1]。本研究通过观察法舒地尔和罗格罗酮对脂多糖(LPS)诱导的人冠状动脉(冠脉)内皮细胞(HCAEC)血管细胞黏附因子1(VCAM-1)、单核细胞趋化因子1(MCP-1)表达的影响，旨在观察法舒地尔与罗格列酮是否有协同抑制血管炎症反应的作用。

1　材料与方法

1.1材料HECAC、ECM1001培养基、青霉素/链霉素(P/S)、胎牛血清(FBS)、内皮细胞因子(ECGs)均购自美国sciencecell公司，0.25%胰酶购自Gibco公司，LPS购自Sigma公司，法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司，罗格列酮购自Alexis biochemicals公司，ELISA试剂盒购自eBioscience公司。

1.2法舒地尔、罗格列酮、LPS处理细胞方法将HCAEC从液氮罐中取出后置于37 ℃水浴箱中，溶化后立即转移到含4 mL完全培养基(完全培养基的配制是500 mL ECM+25 mL FBS+5 mL ECGs+5 mL P/S)的培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，第2天换液，之后每隔3 d换1次液，换液时倒净培养瓶中液体，PBS冲洗2遍，加入新完全培养液4 mL，待细胞长满80%左右时传代。实验时取第3～5代细胞，用完全培养基稀释成2×105/孔种植于6孔板中，当细胞长到约80%时，将细胞分成6组：空白对照组(ECM培养基)、LPS组(培养基中加入终浓度为100 ng/mL LPS[2])、法舒地尔组(培养基中加入终浓度为10 nmol/L法舒地尔[3])、罗格列酮组(培养基中加入终浓度为10 μg/mL罗格列酮[4])、LPS+法舒地尔组(先予终浓度为10 nmol/L的法舒地尔干预2 h后再给予终浓度为100 ng/mL LPS共同干预22 h)、LPS+法舒地尔+罗格列酮组(先予终浓度为10 nmol/L的法舒地尔和浓度为10 μg/mL罗格列酮干预2 h后再给予终浓度为100 ng/mL LPS共同干预22 h)。上述细胞均于培养箱中培养24 h，所有细胞的RNA、上清液均被收集保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA检测方法RNA提取、逆转录分别使用TaKaRa公司的TRIzol试剂盒和逆转录试剂盒，按照说明书进行操作，提取的总RNA用BECKMAN COULTER核酸蛋白分析仪测其在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，所有样品的A260与A280的比值为1.8～2.1。并根据A260值对样品的总RNA进行初步定量，逆转录成cDNA后保存于-80 ℃冰箱备用。实时荧光定量PCR测定在ABI StePone Plus上完成，mRNA表达水平用SYBR Premix EX Taq(Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒)检测。所有样品95 ℃热变性60 s，40个循环，每个循环包括95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。引物序列：VCAM-1上游为5′-CAGCCTCTTTCTGAGAATGCAAC-3′，下游为5′-TGACAGTGTCTCCTTCTTTGA-CACT-3′；MCP-1上游为5′-CAGCCTCTTTCTGAGAA-TGCAAC-3′，下游为5′-TGACAGTGTCTCCTTCTTTGACACT-3′；GAPDH上游为5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游为5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′。HECAC中VCAM-1、MCP-1 mRNA表达水平以GAPDH为内参测算，VCAM-1的cDNA需稀息10倍再行PCR反应。以2-ΔΔCt计算分析mRNA的表达量，将空白对照组标准化为1。

1.4细胞上清液中可溶性VCAM-1、MCP-1蛋白检测实验前，将上清液予分析缓冲液(ASsay buffer)分别稀释成1倍、5倍、10倍、20倍、100倍，按照说明书步骤进行操作以确定最佳的上清液作用浓度，MCP-1的上清液稀释100倍后进行蛋白检测，VCAM-1的上清液无需稀释即可进行蛋白检测。使用试剂盒提供的MCP-1、VCAM-1标准品按操作说明建立标准曲线，标准曲线方程式分别为Y=0.001 5X+0.056 9(R2=0.998 5)，Y=0.018 9X+0.092 6(R2=0.999 3)，根据方程式求出各组细胞上清液中MCP-1、VCAM-1蛋白的表达量。

2　结果

各组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA比较见表1。各组细胞上清液VCAM-1、MCP-1蛋白比较见表2。

3　讨论

VCAM-1、MCP-1在动脉粥样硬化早期病变中扮演着非常重要的角色[5,6]，抑制血管内皮细胞VCAM-1、MCP-1的表达对动脉硬化的发展能起到抑制的作用。LPS在革兰阴性细菌感染及疾病演化中有重要作用，被认为是造成全身性炎症反应综合征的主要原因，与细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传递链，引起NF-κB等活化，启动基因转录，表达和释放多种细胞因子，发挥其毒性作用。本研究以LPS作为促进冠脉内皮细胞炎症反应的诱导剂，结果显示，与空白对照组相比，LPS可明显增加冠脉内皮细胞VCAM-1、MCP-1的表达。

表1　各组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与LPS组相比，△P<0.05；与LPS+法舒地尔组相比，#P<0.05。

表2　　　　各组细胞上清液VCAM-1、MCP-1蛋白比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与LPS组相比，△P<0.05；与LPS+法舒地尔组相比，#P<0.05。

Rho/ROCK信号通路在动脉粥样硬化的发生发展中发挥了重要的作用，其通过不同途径活化后促进动脉粥样硬化的形成。Rho激酶的活化可能通过调节NF-κB的活性和T淋巴细胞的增殖，参与早期动脉粥样硬化的形成。Rho激酶及其下游p38MAPK/NF-κB信号通路的激活可诱导血管内皮细胞MCP-1的表达。法舒地尔是Rho激酶抑制剂，其可通过下调p38MAPK和NF-κB的活性从而下调MCP-1、VCAM-1的表达[1,7]，本研究也证明了法舒地尔可以下调LPS诱导的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表达。

过氧化物酶增殖物激活受体-γ激动剂吡格列酮可通过抑制p38MAPK蛋白活性从而抑制炎症反应过程，罗格列酮可以通过抑制NF-κB蛋白活性下调高糖诱导的VCAM-1的表达。本研究结果表明，罗格列酮和法舒地尔联用可协同抑制LPS诱导的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表达，其作用机理可能与法舒地尔、罗格列酮抑制某些共同的信号通路有关。MAPK及NF-κB是动脉内皮细胞内两条非常重要信号通路，在炎症信号转导调控中具有重要意义。p38MAPK是MAPK家族中的重要成员，是介导细胞反应的重要信号系统，与血管内皮细胞损伤有关[8]。NF-κB是调控转录多种炎症因子的中心环节和共同通路，是血管内皮细胞损伤进展过程中炎症反应的关键环节。研究[9]发现，p38MAPK被激活后可通过磷酸化或促炎细胞因子(如TNF-α、ICAM-1)而活化NF-κB。NF-κB被激活后，也可通过其促炎细胞因子产物反过来激活p38MAPK。p38MAPK与NF-κB形成的相互激活网络可调控多种炎症介质的基因表达，促进动脉粥样硬化的发展。

综上可见，法舒地尔联合罗格列酮可协同抑制LPS诱导的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表达，可能与两者共同抑制p38MAPK、NF-κB信号通路有关。

[1] Daiji K, Keiichiro M, Yasushi K, et al. Thrombin induces MCP-1 expression through Rho-kinase and subsequent p38MAPK/NF-κB signaling pathway activation in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 411(4):798-803.

[2] Walia DS, Sharma M, Raveendran VV, et al. Human mast cells (HMC-1 5C6) enhance interleukin-6 production by quiescent and lipopolysaccharide-stimulated human coronary artery endothelial cells[J]. Mediators Inflamm, 2012,2012(1):274347.

[3] Li H, Peng W, Jian W, et al. ROCK inhibitor fasudil attenuated high glucose-induced MCP-1 and VCAM-1 expression and monocyte-endothelial cell adhesion[J]. Cardiovasc Diabetol, 2012,11:65.

[4] Qing C, Jing C, Tao S, et al. A yeast two-hybrid technology-based system for the discovery of PPARgamma agonist and antagonist[J]. Anal Biochem, 2004,335(2):253-259.

[5] Piconi L, Quagliaro L, Da Ros R, et al． Intermittent high glucose enhances ICAM- 1，VCAM- 1，E- selectin and in-terleukin- 6 expression in human umbilical endothelial cells in culture: the role of poly(ADP- ribose) polymerase[J]. J Thromb Haemost， 2004，2(8):1453-1459．

[6] Papadopoulou C， Corrigall V， Taylor PR， et al． The role of the che-mokines MCP-1，GRO-alpha，IL-8 and their receptors in theadhesion of monocytic cells to human atherosclerotic plaques[J]． Cytokine， 2008，42(3):345-350.

[7] Lu Y, Li H, Jian W, et al. The Rho/Rho-associated protein kinase inhibitor fasudil in the protection of endothelial cells against advanced glycation end products through the nuclear factor κB pathway[J]. Exp Ther Med, 2013,6(2):310-316.

[8] Jun F, Yuhong L, Nikola D, et al. Altered expression and activation of mitogen-activated protein kinases in diabetic heart during cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass[J]. J Surg Res, 2013,154(3):436-443.

[9] Rajaa EB, Moisés A, Javier M, et al. Oxidative stress is a critical mediator of the angiotensin Ⅱ signal in human neutrophils: involvement of mitogen-activated protein kinase, calcineurin, and the transcription factor NF-kappa B[J]. Blood, 2003,102(2):662-671.

Effects of fasudil combined with rosiglitazone on expression of MCP-1 and VCAM-1 in lipopolysaccharide-induced human coronary arterial endothelial cells

LIShiyun,WUXianghong,HUANGWen,WANGChun,MAGuotian,BIQi

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of fasudil combined with rosiglitazone on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) in lipopolysaccharide (LPS)-induced human coronary arterial endothelial cells (HCAECs). MethodsWe conducted the experiment using the 3rd to the 5th generation of HCAECs in vitro. Then, the cells were divided into the control group (non-intervention), LPS group (HCAECs were intervened with 100 ng/mL LPS), fasudil group (HCAECs were intervened with 10 nmol/L fasudil), rosiglitazone group (HCAECs were intervened with 10 μg/mL rosiglitazone), LPS + fasudil group (HCAECs were intervened with 10 nmol/L fasudil for 2 h followed by 100 ng/mL LPS for 22 h), LPS + fasudil + rosiglitazone group (HCAECs were intervened with 10 nmol /L fasudil and 10 μg/mL rosiglitazone for 2 h followed with 100 ng/mL LPS together for 22 h). The protein expression of VCAM-1 and MCP-1 in supernatant was detected by ELISA and the mRNA was detected by real-time fluorescent quantification PCR. ResultsCompared with the control group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was increased in the LPS group (allP<0.05). Compared with the LPS group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was decreased in the LPS + fasudil group (allP<0.05). Compared with LPS+fasudil group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was decreased in the LPS+fasudil+ rosiglitazone group (allP<0.05).Conclusion Fasudil combined with rosiglitazone collaboratively inhibits the expression of VCAM-1 and MCP-1 in HCAECs induced by LPS, which may be related to their co-suppression of p38MAPK and NF-κB signaling pathway.

atherosclerosis; human coronary artery endothelial cells; vascular cell adhesion molecule 1; monocyte chemotactic protein 1

国家自然科学基金资助项目(81360057)。

李世云(1979-)，男，硕士研究生，主要从事冠心病的发病机制及介入治疗。E-mail: 411955433@qq.com

简介：巫相宏(1967-)，男，教授，硕士生导师，主要从事冠心病防治的基础和临床研究、冠心病的介入性诊断治疗。E-mail: whw780@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.004

R543

A

1002-266X(2016)23-0013-03

2016-01-11)