拟青霉FLH30 β-葡萄糖苷酶动力学、激活抑制及其转糖苷

华承伟,于江傲,李　兰,常景玲,张志宏

(河南科技学院生命科技学院,河南新乡 453003)



拟青霉FLH30 β-葡萄糖苷酶动力学、激活抑制及其转糖苷

华承伟,于江傲,李兰,常景玲,张志宏

(河南科技学院生命科技学院,河南新乡 453003)

研究了拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶动力学性质及葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸内酯对该酶的激活及抑制作用。结果表明:该酶对pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、纤维二糖、乳糖、龙胆二糖和水扬苷的水解动力学常数Km分别为0.54、5.28、0.98、26.34、6.92和1.72 mmol/L;在以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物时,5～150 mmol/L葡萄糖和20～600 mmol/L木糖对酶有激活作用,高于此范围,则表现出抑制作用,葡萄糖醛酸内酯具有很强的抑制作用,葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸内酯抑制常数Ki值分别为63.4、170.3和0.038 mmol/L。木糖能促进该酶对纤维二糖和乳糖的水解作用,木糖浓度为200 mmol/L时,酶活分别增加189.6%和166.3%。该酶还具有转糖苷活性,能够将纤维二糖部分转化为纤维三糖和龙胆二糖。

β-葡萄糖苷酶,动力学,激活,抑制,转糖苷

β-葡萄糖苷酶在食品、医药和化工行业具有广泛的用途[1],按其存在位置,可分为胞内和胞外β-葡萄糖苷酶。微生物的胞内β-葡萄糖苷酶为β-葡萄糖苷酶A,并与人体内的乳糖酶、根皮苷水解酶有高度的同源性,而胞外β-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶B同源[2]。糖苷水解酶1家族的β-葡萄糖苷酶作用底物广泛,大部分β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差,能裂解C-O糖苷键、C-S键、C-N键、C-F键等;有些对糖基部分的C4和C2构形也不专一,能同时水解β-葡萄糖苷酶键和β-半乳糖苷键;有些甚至C6位的专一性也不高,葡萄糖苷酶能够催化水解半缩醛与环状醛糖-OH之间的糖苷键,或是葡萄糖与其它化合物如糖、氨基醇、芳基醇或甲醇、乙醇和丙醇上的-OH之间的糖苷键;但在所有天然底物中,β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强[3]。β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖、昆布二糖、槐糖和邻硝基苯-β-D-葡萄糖苷,但是对其它的一些葡萄糖或是纤维二糖通过β-糖苷键连接起来的复合物水解速率非常低[4]。

β-葡萄糖苷酶一般受底物葡萄糖的抑制,但近来发现一些能被葡萄糖和木糖激活的β-葡萄糖苷酶,如特异腐质霉(Humicola insolens)[5]、嗜热柱霉(Scytalidum thermophilum)[6]、灰腐殖霉高温变种(Humicola grisea var. thermoidea)[7],另外还发现一些葡萄糖苷酶在不同温度,不同底物和葡萄糖浓度下表现出的抑制和激活作用也不一样[8]。因此,研究不同来源β-葡萄糖苷酶的动力学性质、激活和抑制作用,对于探索该酶作用机制,实际应用及拓宽该酶在医疗等领域的应用具有重要的意义。本研究拟对分离得到的一株耐热真菌拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶的部分底物的动力学参数进行测定,同时,探索葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸内酯对该酶的激活及抑制作用,为该酶的应用奠定一定的基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶10 mg/mL,本实验室分离纯化,电泳纯;葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸内酯、纤维二糖、纤维三糖、乳糖、pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、水杨苷Sigma公司,分析纯;纤维四糖自制;葡萄糖氧化酶试剂盒北京北化康泰化学试剂有限公司;其它试剂均为分析纯。

Kieselgel 60层析板德国Merck公司;TU-1800PC紫外可见分光光度计北京普析通用仪器设备有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1动力学参数测定采用50 mmol/L,pH6.0 Na2HPO4-Citric缓冲液分别配制pNP-糖苷、纤维二糖、龙胆二糖、乳糖、龙胆二糖和水扬苷反应底物,使底物浓度在0.1～60 mmol/L之间,55 ℃反应2 min,测定酶活。pNP-糖苷类底物以水解释放出pNP的速率来计算酶活力,二糖底物通过检测水解过程中释放出葡萄糖的速率来计算酶活力。葡萄糖的浓度采用葡萄糖氧化酶试剂盒测定。酶活力单位定义为在上述条件下每分钟反应生成1 μmol pNP、葡萄糖或还原糖所需要的酶量。其中纤维二糖和龙胆二糖,一个酶活力单位为生成2 μmol的葡萄糖的量,将底物浓度(mmol/L)和反应速率(μmol·min-1·mg-1)输入酶动力学软件Grafit测定Km和Vmax。

1.2.2葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-内酯对β-葡萄糖苷酶的作用以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制10 mmol/L的pNPG,分别加入终浓度为5～1000 mmol/L的葡萄糖、木糖及葡萄糖和木糖的混合液(葡萄糖和木糖混合液分别添加等浓度的葡萄糖和木糖,每种糖的浓度和单糖作用时浓度一致),D-葡糖酸-δ-内酯浓度为0.01～2 mmol/L每毫升反应体系加入对pNPG 1个单位的酶活,55 ℃反应10 min,按1.2.1测定酶活,以不加糖的体系作为100%对照,研究葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-内酯对β-葡萄糖苷酶活性的影响。

以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制底物(纤维二糖和乳糖)溶液、激活剂(木糖)溶液,整个反应体系控制底物终浓度为10 mmol/L,添加不同浓度木糖(20～600 mmol/L),55 ℃反应2 min,按1.2.1测定酶活,以不加木糖的酶活作为100%对照,研究木糖对该酶水解10 mmol/L纤维二糖和10 mmol/L乳糖的影响。

1.2.3葡萄糖醛酸内酯抑制常数Ki的测定整个反应体系以50 mmol/L pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制,使pNPG浓度为0.5、1.0和1.5 mmol/L,葡萄糖醛酸内酯浓度0.025～0.15 mmol/L,55 ℃反应2 min,分别测定在3个底物浓度、不同内酯浓度下的初速度(每毫升反应体系加入对pNPG 2个单位的酶活,使底物消耗量小于10%),以速率的倒数对内酯的浓度作图,通过Dixon plots求得,每个反应作三个平行。

1.2.4葡萄糖和木糖抑制常数Ki的测定pNPG和葡萄糖、pNPG和木糖反应体系以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制,使pNPG浓度为0.5、1.0和1.5 mmol/L,葡萄糖浓度为300、400和600 mmol/L,木糖浓度800、900和1000 mmol/L,55 ℃反应2 min。分别测定不同底物浓度下的初速度(每mL反应体系加入对pNPG 1个单位的酶活,使底物消耗量小于10%),以速率v的倒数对葡萄糖和木糖浓度的倒数作图,利用SigmaPlot Enzyme Kinetics Module(Systat Software Inc. San Jose,California,USA)分析软件分析,通过Lineweaver-Burk作图法求得,每个反应作三个平行。

1.2.5葡萄糖和木糖激活常数K0.5的测定整个反应体系以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制。底物pNPG浓度分别配制两个范围:低浓度范围(0.15～0.9 mmol/L)和高浓度范围(1.5～4 mmol/L)。低底物浓度下,葡萄糖和木糖浓度分别为5和20 mmol/L;高底物浓度下,葡萄糖和木糖浓度分别为50和200 mmol/L,分别测定不同底物浓度下的反应速率。利用SigrafW software(http://portal.ffclrp.usp.br/sites/ivana/downloads)[9],以v/V对lg[S]作图,使用方程:

式中v为反应速率;V1和V2分别为酶与多底物结合位点的最大反应速率;S为底物浓度;n1和n2为Hill系数;K1和K2为酶与底物结合常数。

1.2.6转糖苷实验以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric缓冲液配制5%、10%、15%、20%的纤维二糖和10 mmol/L的pNPG,分别添加终浓度为0.5 U/mL和1.0 U/mL的β-葡萄糖苷酶55 ℃保温,定时取样沸水浴10 min灭酶活,上样2 μL进行薄层层析(TLC)分析,展层系统为正丁醇/乙酸/水系统(2∶1∶1,v/v/v),将水解的样品点样后展开两次,吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95,v/v)溶液浸湿,最后在130 ℃烘箱中烘烤显色。同时,为考察葡萄糖对酶的激活可能是转糖苷作用,在pNPG为10 mmol/L时,分别加入100 mmol/L葡萄糖和木糖,按上述方法进行TLC分析。分别称取等量的纤维多糖、葡萄糖和木糖配制成总浓度为0.1 g/mL纤维多糖标准品Gn、纤维多糖+木糖标准品Gn+X。

表1　β-葡萄糖苷酶的动力学参数

图1　葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-内酯对葡萄糖苷酶的影响Fig.1　Effects of glucose,xylose and D-δ-gluconolactone注:a:底物pNPG浓度为5 mmol/L时葡萄糖和木糖对酶的影响;b:木糖对酶水解10 mmol/L纤维二糖和10 mmol/L乳糖的影响;c:D-葡糖酸-δ-内酯对重组酶的影响。

2　结果与讨论

2.1动力学参数测定

图2　D-葡糖酸-δ-内酯(a)、葡萄糖(b)和木糖(c)对葡萄糖苷酶的抑制常数Fig.2　Effects of D-δ-gluconolactone(a),glucose(b)and xylose(c)

由表1可知,该酶具有较宽的底物作用范围,其中对pNP-β-D-葡萄糖苷有较高的催化效率,其次是纤维二糖,Kcat/Km分别为10.15 mg-1·s-1·mL和5.36 mg-1·s-1·mL。

2.2葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-内酯对葡萄糖苷酶的作用

由图1可知,一定浓度的葡萄糖(5～150 mmol/L)和木糖(20～600 mmol/L)对酶有激活作用,高于此值,则表现出抑制作用,其中葡萄糖在40 mmol/L、木糖在200 mmol/L时激活作用最强,使酶活力分别增加114.3%和155.2%(图1a),在木糖浓度为200 mmol/L时,该酶对纤维二糖和乳糖的酶活分别增加为189.6%和166.3%(图1b)。此酶较耐葡萄糖的抑制,1000 mmol/L的浓度酶活还保持在20%以上。结果显示,混合糖激活作用在总糖浓度小于200 mmol/L时,处于两种单糖激活作用之间(图1a),表明该β-葡萄糖苷酶可能为单一激活位点。由图1c可知,D-葡糖酸-δ-内酯强烈抑制酶活。

2.3葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-内酯抑制常数Ki的测定

采用Dixon作图法及Lineweaver-Burk法测得D-葡糖酸-δ-内酯(图2a)、葡萄糖(图2b)、和木糖(图2c)的Ki值分别为0.038、63.4和170.3 mmol/L。

2.4葡萄糖和木糖激活作用

动力学研究表明,在不同底物(pNPG)浓度下,葡萄糖和木糖对葡萄糖苷酶的激活作用也不一样。由图3、图5可知,在底物浓度<1 mmol/L时,激活作用随糖浓度的增加而减小,在底物浓度>2 mmol/L时,激活作用随糖浓度的增加而增大。K0.5值计算利用SigrafW software非线性拟合方法进行。在底物浓度<1 mmol/L,葡萄糖浓度为5和50 mmol/L时,激活常数K0.5分别为0.36和0.78 mmol/L(见图4);木糖浓度为20和200 mmol/L时,激活常数K0.5分别为0.51和1.18 mmol/L(见图6)。

图3　不同浓度的葡萄糖对酶反应速率的影响Fig.3　Different content of glucose influce on initial velocity

图4　低底物(pNPG)浓度(a)和高底物浓度(b)下Hill方程非线性拟合曲线Fig.4　Plot of v/V versus log[pNPG]for the hydrolysis of pNPG in low/high concentration of pNPG注:(a)底物浓度小于1 mmol/L,葡萄糖浓度5 mmol/L;(b)底物浓度大于1 mmol/L,葡萄糖浓度50 mmol/L。

图5　不同浓度的木糖对酶反应速率的影响Fig.5　Different content of xylose influce on initial velocity

图6　低底物(pNPG)浓度(a)和高底物浓度(b)下Hill方程非线性拟合曲线Fig.6　Plot of v/V versus log[pNPG]for the hydrolysis of pNPG in low/high concentration of pNPG注:(a)底物浓度小于1 mmol/L,木糖浓度20 mmol/L;(b)底物浓度大于1 mmol/L,木糖浓度200 mmol/L。

2.5转糖苷实验

葡萄糖对该酶的激活另一方面可能是转糖苷作用的结果,在pNPG为10 mmol/L,葡萄糖为100 mmol/L时,在最初的1 h内观察到有二糖的生成(图7a)。而添加木糖(图7b)没有观察到有产物生成。

图7　以pNPG为底物时葡萄糖(a)和木糖(b)对酶影响的TLC分析Fig.7　Analysised production of pNPG and glucose(a)or xylose(b)by TLC at different time注:Gn:纤维多糖标准品;Gn+X:纤维多糖+木糖标准品。

图8　以纤维二糖为底物转糖苷作用的TLC分析Fig.8　Analysised transglycosylation using cellobiose as substrate at different time 注:a～d加酶量为0.5 U/mL;e～h:加酶量为1.0 U/mL。

以纤维二糖为底物的转糖苷作用:当加酶量为0.5 U/mL时,在5%浓度的底物,在24 h合成的三糖量达到最大,随后降低(图8a)。而10%、15%和20%的底物浓度,在60 h内,随时间的增加,合成的三糖量逐渐增加(图8b～d)。由图8a～d可知,同时在5%底物浓度时,合成的龙胆二糖(纤维二糖与纤维三糖之间的斑点)随时间增加而增加,而高浓度的底物,龙胆二糖合成量较少。由图8e～h可知,加酶量为1.0 U/mL时,5%底物浓度在48 h后,产物主要为单糖和龙胆二糖;在底物浓度为10%时,在单糖与二糖之间又生成一新糖,同时,龙胆二糖明显比加酶量为0.5 U/mL时要多;而在底物浓度为15%和20%时,龙胆二糖含量相比低底物浓度时明显又逐渐减少,三糖含量没有明显变化。

3　结论与讨论

本研究对新得到的拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶进行了底物动力学参数的测定,其中对天然底物纤维二糖具有较高的催化效率,这为该酶的多底物水解在实际应用中提供了生产参数借鉴。一定浓度的葡萄糖(5～150 mmol/L)和木糖(20～600 mmol/L)对该酶有激活作用,同时,木糖还能促进该酶对纤维二糖和乳糖的水解作用;而葡萄糖醛酸内酯对该酶具有很强的抑制作用。这可能为该酶在实际应用中扩大其应用范围,如乳糖的水解等,解除一些抑制因素等提供一定的指导意义。该酶能以pNPG和纤维二糖为底物产生转糖苷作用,能够将纤维二糖部分转化为纤维三糖和龙胆二糖,在实际应用中可用于合成芳基、烷基糖及其它低聚糖。

其中,木糖和葡萄糖的激活作用表明,该β-葡萄糖苷酶中可能存在激活位点,且葡萄糖和木糖参与激活作用时,结合的位点为一个位点,但这个激活位点是位于活性中心内还是活性中心外还不确定,需要结合结构生物学进一步证实。Laurent Fourage等[10]研究了来源于Thermusthermophilus的1家族β-葡萄糖苷酶(Ttβgly)的作用机制,他们认为,在低温和高浓度底物下,(Gly-X,X:芳基)形成E-Gly/Gly-X,从而表现出抑制现象,在较高温度下,转糖苷机制占主要作用,形成Gly-Gly-X,表现出激活作用。当加入一定浓度的葡萄糖时,在低的底物浓度和较低温度下,葡萄糖和底物竞争结合酶的活性中心,表现出抑制现象,而当底物高于一临界浓度且温度高于一定值的时候,葡萄糖可以作为糖苷受体生成Gly-Glc从而表现出激活现象。而来源于拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶在低底物浓度下,随葡萄糖和木糖浓度的增加这种激活作用越明显,当底物高于一定浓度,激活作用反而变小,转糖苷作用也是在低底物浓度下速度快、产量高,同时实验结果发现,提高酶量,在适宜的底物浓度下,合成新糖的种类也增加。由于不同来源的β-葡萄糖苷酶差异比较大,组成(β/α)8口袋式结构的(pocket or crater)深度和长度不一样,其结合底物链的长度也不一样[11-12],活性中心氨基酸的组成及蛋白单体的聚合形式等都对酶的性质造成影响,导致不同来源物种及同一物种的不同糖苷酶也千差万别,其具体作用方式有待于进一步研究。

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Kinetics,activation,inhibition and transglycosylation of theβ-glucosidase fromPaecilomycessp. FLH30

HUA Cheng-wei,YU Jiang-ao,LI Lan,CHANG Jing-ling,ZHANG Zhi-hong

(School of Life Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Theβ-glucosidase fromPaecilomycessp. FLH30 exhibited a broad substrate specificity. The enzyme hydrolyzed pNPG,pNP-β-D-galactoside,cellobiose,lactose,salicin,gentiobiose,exhibiting apparent kinetics constant(Km)values of 0.54,5.28,0.98,26.34,6.92 and 1.72 mmol/L,respectively. A certain concentration of glucose(5～150 mmol/L)and xylose(20～600 mmol/L)had an activation on the enzymes use pNPG as substrate,above the value then demonstrated inhibition. Glucuronolactone had strongly inhibited the enzyme activity,the value of inhibite constant Kiof glucose,xylose and glucuronolactone was 63.4,170.3 and 0.038 mmol/L. Xylose also had an activation on the enzyme hydrolysis of cellobiose and lactose,the enzyme activity increased by 189.6% and 166.3% respectively in the xylose concentration 200 mmol/L. Furthermore,the enzyme showed transglycosylation activity and could produced cellotriose and gentibiose use cellobiose as substrate.

β-glucosidase;kinetics;activation;inhibition;transglycosylation

2015-07-06

华承伟(1972-)，男，博士，副教授，研究方向：酶工程、食品生物技术，E-mail：cwhua@hist.edu.cn。

河南科技学院重点科研项目(201010611004)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)16-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.018