MAV3104与鸟胞内分枝杆菌复合群耐克拉霉素作用研究

胡锦兴 彭德虎 梁小朋 何司琪 韩建芳 吴碧彤 罗立全 冯永忠 林兆原

·论著·

MAV3104与鸟胞内分枝杆菌复合群耐克拉霉素作用研究

胡锦兴 彭德虎 梁小朋 何司琪 韩建芳 吴碧彤 罗立全 冯永忠 林兆原

广州市胸科医院肺外结核八内科（广州510095）

目的 研究鸟胞内分枝杆菌复合群（MAC）MAV3104基因编码蛋白与药物外排的关系。方法 以MAC标准株基因组为模板，扩增MAV3104基因，构建pMV261-MAV3104c重组质粒；测序正确后，转化重组质粒到大肠杆菌DH5并在MAC标准株中诱导表达，Western Blot鉴定MAV3104表达；按照CLSIM24-A2的操作要求检测MAC标准株对克拉霉素的敏感性及外排泵抑制试验。结果 经基因测序及Western Blot蛋白表达验证重组质粒构建成功；MAV3104过表达能提高鸟分枝杆菌对克拉霉素的MIC，且硫利达嗪能抑制该作用；MAV3104过表达也能提高胞内分枝杆菌对克拉霉素的MIC，但硫利达嗪对其没有抑制效应。结论 MAV3104转运蛋白介导的药物外排在鸟分枝杆菌耐克拉霉素中起重要作用。

鸟胞内分枝杆菌复合群 MAV3104 耐药 克拉霉素

非结核分枝杆菌（nontuberculousmycobacte-ria，NTM）是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的统称［1］。通常认为非结核分枝杆菌为条件致病菌，其中某些菌可以引起肺部、淋巴结、皮肤组织等感染［2］。近些年来，流行病学数据表明全世界范围内由非结核分枝杆菌引起的肺病呈上升趋势。全国流行病学抽样调查结果显示：NTM在分枝杆菌培养阳性标本中的比例由1990年的4.9%增加到2000年的11.1%［3］，2010年增至22.9%［4］，以每10年约1倍的速度增长。因此，非结核分枝杆菌同样是我国面临的一个重大的公共卫生问题。

在所有非结核分枝杆菌种类中，鸟分枝杆菌复合群是最为常见的致病菌［5］。它主要包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌两种［6］，它们在致病性和其他生物学特性方面表现出较大的差别［7］。

鸟胞内分枝杆菌复合群（MAC）感染的治疗非常棘手，克拉霉素被常规用于MAC感染的治疗［8］，但克拉霉素耐药的MAC临床株迅速增加，其具体的耐药机制并不清楚。有研究显示MAV3104在结核分枝杆菌复合群（MTC）中的相似蛋白——Rv1667c，已被证实在MTC耐受克拉霉素中发挥重要作用［9］，故我们推测，MAC中的MAV3104很大可能也是一种克拉霉素特异的转运蛋白，其表达及功能改变导致耐药发生。本研究探讨MAV3104在MAC克拉霉素耐药中可能的作用及其机制，以期为NTM耐药机制研究提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体 MAC标准株均购自美国菌种保藏中心，分别是：鸟分枝杆菌ATCC25291，胞内分枝杆菌ATCC13950。E.coli DH5购自Takara公司，pMV261Vector大肠杆菌与MAC的穿梭质粒载体，4488 bp，含卡那霉素抗性，为广州市胸科医院保存。

1.1.2 试剂与仪器 DNA提取液购自德国QIAGEN公司。Takara TaqTM普通PCR试剂、DNA Marker购自日本Takara公司。1.5 mL微离心管、PCR反应管购自美国Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计合成 参照GeneBank中各基因的标准序列，应用Primer Premier 6.0软件设计各自的扩增引物和测序引物；设计好的引物交由专门的公司进行合成。

1.2.2. 普通PCR 50μl的PCR反应总体系包括5μl 10 ×PCR Taq Buffer、4μl 2.5 mM dNTP溶液、50μM引物各0.5μl、1.25 U Taq DNA聚合酶和2μl的DNA模板。反应体系在普通PCR仪上进行反应，反应条件为94℃预变性2 min，94℃变性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸2 min共30个循环，72℃补齐3 min。

1.2.3 逆转录PCR ①采用商品化试剂盒提取MAC的RNA，严格按照试剂盒的说明进行操作，经过破壁、裂解、沉淀、纯化、干燥和溶解等步骤后将提取的总RNA置-80℃保存备用。②20μl的逆转录体系包括4μl缓冲液、0.5μl RNA酶抑制剂、逆转录酶溶液1μl、总RNA溶液10μl和4.5μl DEPC水。逆转录反应条件为30℃10 min，42℃60 min，95℃5 min。③实时荧光PCR的反应体系为20 μl，包括10μl的MightyAmp Mix、0.4μl的ROX参比荧光染料、50μM的引物各0.2μl、8.2μl的ddH2O和1μl的cDNA模板。在实时荧光定量PCR仪上进行反应，应用仪器配套的分析软件进行扩增分析。反应条件为98℃预变性2 min，98℃变性10 s、65℃退火延伸15 s共30个循环，68℃补齐30 s。熔解曲线分析程序为：95℃变性15 s，60℃复性1 min，以0.05℃/s的速度升温至95℃并维持15 s，最后60℃复性15 s。

1.2.4 质粒构建和转化 PCR扩增目的片段后，选用核酸内切酶AccⅢ和Bsp1061对PCR产物和质粒分别进行酶切，接着将酶切后的PCR产物与穿梭质粒pMV261进行连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌中，涂板培养后挑取单克隆进行酶切鉴定，最后把阳性克隆测序以确定目的片段是否已被正确克隆。采用醋酸锂方法将质粒转化进MAC临床敏感株中，取新鲜培养的MAC洗涤两次后，用醋酸锂悬浮两次后分装于微量离心管中，依次加入其它转化用试剂和DNA后，剧烈振荡并水浴离心重悬即可。

1.2.5 DNA序列测定 采用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析，并将片段大小符合且亮度很高的PCR产物送核酸测序公司进行序列测定。测序结果采用Chromas2软件进行处理，DNA序列采用DNAMAN软件进行对比分析。

1.2.6 Western Blot检测蛋白表达水平 将MAC标准株分别培养一周后，取培养液离心，离心后取沉淀用于MAV3104表达水平检测，确定MAV3104过表达是否成功。提取沉淀中的总蛋白并进行初步浓度测定，将浓度做适当稀释后用于Western Blot试验，进行半定量分析。

1.2.7 检测MAC标准株对克拉霉素的敏感性 将鉴定为MAC的临床菌株转种培养，待长出肉眼可见的菌落后进行药敏试验，严格按照CLSIM24-A2的要求进行操作。

1.2.8 泵抑制试验 克拉霉素预处理MAC一周后，加入泵抑制剂硫利达嗪，培养2h后取一半培养液进行克拉霉素敏感性检测。取另一半培养液进行离心，应用液相色谱仪检测上清液中克拉霉素浓度；将沉淀洗涤后提取总RNA并进行RT-PCR，检测MAV3104编码基因的转录水平。

1.2.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，连续变量¯x±s表示，组间比较采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果及MAV3104重组质粒的构建与鉴定：MAV3104基因PCR产物经1%凝胶电泳后得到约1775 bp的特异性条带，大小与预测一致，见图1。以载体pMV261-MAV3104为模板进行PCR扩增，产物大小约1775 bp，核酸内切酶AccⅢ和Bsp1061双酶切鉴定结果见图2。选取MAV3104阳性质粒至上海生物工程有限公司测序，测序结果均与NCBIBlast结果完全吻合，证实重组质粒pMV261-MAV3104构建成功。

图1 MAV3104扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图

2.2 转染后MAV3104在鸟分枝杆菌中的基因表达情况：转染了pMV261-MAV3104质粒的鸟分枝杆菌中的MAV3104 mRNA表达水平高于空白对照及空载体对照组（8.46± 0.15 vs 0.99±0.05，8.46±0.15 vs 1.36±0.05）（P＜0.05），空白对照及空载体对照组之间无差异，见图3；转染了pMV261-MAV3104质粒的胞内分枝杆菌中的MAV3104 mRNA具有同样的结果，（7.56±0.24 vs 0.95± 0.13，7.56±0.24 vs 1.42±0.08）（P＜0.05），见图4。

2.3 鸟胞内分枝杆菌MAV3104蛋白的Western blot鉴定结果：转染了pMV261-MAV3104质粒的鸟分枝杆菌中的MAV3104蛋白表达水平高于空白对照及空载体对照组（0.264±0.05 vs 0.06±0.02，0.264±0.05 vs 0.06±0.01）（P＜0.05），空白对照及空载体对照组之间无明显差异；转染了pMV261-MAV3104质粒的胞内分枝杆菌中的MAV3104蛋白表达具有同样的结果，（0.168±0.04 vs0.05 ±0.01，0.168±0.04 vs0.04±0.03）（P＜0.05），见图5。

图4 三组胞内分枝杆菌MAV3104 mRNA表达水平

图5 三组鸟胞内分枝杆菌MAV3104蛋白的表达水平

2.4 重组鸟分枝杆菌及外排泵抑制剂（硫利达嗪）对克拉霉素MIC影响：重组pMV261-MAV3104鸟分枝杆菌对克拉霉素的MIC高于空载体对照组，而外排泵抑制剂（硫利达嗪）可以部分抑制该情况下MIC的升高（85.2±3.96 vs 24.2±2.77，85.2±3.96 vs 39.8±3.03）（P＜0.05），见图6。

2.5 重组胞内分枝杆菌及外排泵抑制剂（硫利达嗪）对克拉霉素MIC影响：重组pMV261-MAV3104胞内分枝杆菌对克拉霉素的MIC高于空载体对照组，而外排泵抑制剂（硫利达嗪）不能抑制该情况下MIC的升高（67.2±3.12 vs 32.2±2.13，P＜0.05；67.2±3.12 vs 60.8±3.03，P＜0.05），见图7。

图6 重组鸟分枝杆菌菌株对克拉霉素的MIC测定

图7 重组胞内分枝杆菌菌株对克拉霉素的MIC测定

3 讨 论

由于免疫受损及免疫低下人群的扩大，全球NTM感染日益增多［9］。其中，MAC是最常见的条件致病性NTM之一，可引起肺部感染和血液感染等症状［10］。MAC包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，二者在基因组构成非常接近，故常被归于MAC进行研究，但是它们在致病性和其他生物学特性方面表现出较大的差别［7］。有研究表明，鸟分枝杆菌容易感染艾滋病患者，而胞内分枝杆菌更易于使非HIV感染患者致病。此外，与鸟分枝杆菌引起的肺病相比，胞内分枝杆菌引起的肺病症状更严重而且预后更不理想［11］。

以往文献报道鸟胞内分枝杆菌复合群的耐药主要是由于靶基因突变导致MAC对克拉霉素耐药［12-13］。本研究中，过表达MAV3104，可以使到鸟胞内分枝杆菌复合群对克拉霉素的MIC值下降2～3倍以上，故推测MAV3104是MAC胞膜上一种可特异转运克拉霉素等大环内酯类药物的转运蛋白，其过度表达可导致克拉霉素外排增多，从而降低MTC胞内该药物的蓄积浓度，最终通过减少药物对MAC的作用使细菌得以存活。此外，本研究结果显示鸟分枝杆菌外排泵抑制剂硫利达嗪对克拉霉素耐药的抑制率高于对胞内分枝杆菌克拉霉素耐药的抑制率，显示鸟分枝杆菌对克拉霉素的耐药性主要是以外排泵机制为主。

近年来，由于MAC感染患者的剧增和抗生素的不合理使用，克拉霉素耐药的MAC临床株迅速增加［14］。由于能用于MAC感染治疗的药物非常有限，一旦克拉霉素发生耐药，很大程度上也意味着阿奇霉素耐药，这样就几乎没有合适的药物可供选择了。所以，我们必须密切关注MAC克拉霉素耐药并研究其内在分子机制，对临床合理应用抗菌物，减少耐药菌的出现及新药的开发具有重要意义。

［1］唐神结，沙巍，肖和平，等.非结核分枝杆菌病的研究进展［J］.中华结核和呼吸杂志，2012，35（7）：527-531.

［2］孙勤，沙巍.非结核分枝杆菌肺病与肺结核患者的临床特征对比分析［J］.中国防痨杂志，2011，33（2）：120-122.

［3］全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25（1）：3-7.

［4］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告［J］.中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

［5］段鸿飞，土井教生，李琦，等.鸟分枝杆菌复合群对16种抗感染药物药敏试验的分析［J］.中华结核和呼吸杂志，2010，33（5）：359-362.

［6］INDERLIED CB，KEMPER CA，BERMUDEZ LE.The Mycobacterium avium complex［J］.Clin Microbiol Rev，1993，6（3）：266-310.

［7］HAN XY，TARRAND JJ，INFANTE R，et al.Clinical significance and epidemiologic analyses of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare among patients without AIDS［J］.J Clin Microbiol，2005，43（9）：4407-4412.

［8］UCHIYA K，TAKAHASHIH，YAGIT，et al.Comparative genome analysis ofMycobacterium avium revealed genetic diversity in strains that cause pulmonary and disseminated disease［J］.Plos One，2013，8（8）：e71831.

［9］DOUCET-POPULAIRE F，BURIANKOVA K，WEISER J，et al.Natural and acquired macrolide resistance in mycobacteria［J］.Curr Drug Targets Infect Disord，2002，2（4）：355-370.

［10］UCHIYA K，TAKAHASHIH，YAGIT，et al.Comparative genome analysis ofMycobacterium avium revealed genetic diversity in strains that cause pulmonary and disseminated disease［J］.Plos One，2013，8（8）：e71831.

［11］KOH E，IIZASA T，YAMAJIH，et al.Significance of the correlation between the expression of interleukin 6 and clinical features in patientswith non-small cell lung cancer［J］.Int JSurg Pathol，2012，20（3）：233-239.

［12］JIB，LOUNISN，TRUFFOT-PERNOT C，et al.Selection of resistantmutants of Mycobacterium avium in beige mice by clarithromycin monotherapy［J］.Antimicrob A-gents Chemother，1992，36（12）：2839-2840.

［13］MEIER A，KIRSCHNER P，SPRINGER B，etal.Identification ofmutations in 23S rRNA gene of clarithromycinresistant Mycobacterium intracellulare［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38（2）：381-384.

［14］SCHMALSTIEG AM，SRIVASTAVA S，BELKAYA S，et al.The antibiotic resistance arrow of time：efflux pump induction is a general first step in the evolution ofmycobacterial drug resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（9）：4806-4815.

Association of M ycobacterium avium-M ycobacterium intracellulare comp lex in MAV3104 in drug resistance of Clarithromycin

Hu Jinxing，Peng Dehu，Liang Xiaopeng，et al.The Department of Extra-pulmonary Tuberculosis，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China

Objective To investigate the association of the protein coded by Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex in MAV3104 in drug efflux of Clarithromycin. M ethods According to the Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex standard strain，the MAV3104 gene was amplified by PCR and cloned into expression vector pMV261 to generate the recombinant plasmids.After verification by sequence analysis，the recombinant plasmidswas transformed into E.coliDH5 and Mycoba ctenum avium-Mycobacterium intracellulare complex standard strain.To identify the protein expression bywestern blotting and investigate the sensitivity of clarithromycin and efflux pump inhibition test in the lightof CLSIM24-A2 protocol. Results It was verified by sequence analysis and western blotting that the recombinant plasmids were successfully constructed.Over expression ofMycobacterium avium MAV3104 gene could enhance clarithromycin MIC，which could be inhibited by thioridazine.Over expression of Mycobacterium intracellulare MAV3104 gene also could enhance clarithromycin MIC，but it could not inhibited by thioridazine. Conclusion This study demonstrates that efflux pumpsmediated by MAV3104 protein play an important role in Mycobacterium avium resistance to clarithromycin.

Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex；MAV3104；Drug resistance；Clarithromycin

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.001

2016-05-04）

广州市医药卫生科技项目（20151A011037）