氧化石墨烯衍生物对L6细胞活性的影响

余福恒，李仲娟，，陈敏，蔡小康，廖进齐，谭娅玲 (.黄石市东方社区服务中心，湖北黄石435000；.湖北理工学院医学院，湖北黄石435003)

·论著·

氧化石墨烯衍生物对L6细胞活性的影响

余福恒1，李仲娟1，2，陈敏2，蔡小康2，廖进齐2，谭娅玲2(1.黄石市东方社区服务中心，湖北黄石435000；
2.湖北理工学院医学院，湖北黄石435003)

目的研究氧化石墨烯(GO)衍生物对L6细胞活性的影响。方法原代的L6细胞经过1 d或3 d培养，倒置荧光显微镜观察细胞形态并采取电子图片保存；收集对数期成熟的L6细胞，MTT法测定细胞增殖活性；对数期成熟的L6细胞，经GO衍生物3 d的刺激培养，收集细胞培养上清液，采用ELISA方法测定肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)。结果原代L6经过3 d培养，80%以上细胞分化为成熟的L6细胞；0.3μg/m LGO衍生物(GO-L和GO-D)经过3 d刺激，GO-L刺激细胞增殖的OD值为(0.52±0.28)，GO-D刺激细胞增殖的OD值为(0.81± 0.34)，两者与对照细胞OD值(0.18±0.06)比较差异有显著统计学意义(F=6.05，P＜0.01)；其中D型衍生物对L6细胞增殖活性强于L型衍生物，两者之间比较差异有统计学意义(F=4.54，P＜0.05)；L型衍生物和D型衍生物均能诱导L6细胞分泌TNF-α[(18.6±5.36)vs(24.9±8.86)]和少量IFN-γ[(14.3±3.78)vs(13.8±2.62)]。但IFN-γ分泌两者差异无统计学意义(F=0.82，P＞0.05)。结论GO衍生物能诱导L6细胞活化和分泌TNF-α，可能会影响L6细胞中糖的代谢与调节。

氧化石墨烯；细胞增殖；肿瘤坏死因子-α；干扰素-γ

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的单原子层结构以及其相对较大的表面积使其成为药物载体的较佳选择[1]。它不仅可以吸附芳香类药物也可以负载疏水性药物，这对于难溶于水的药物剂型的设计具有重大的意义[2]。最近，GO在聚乙二醇的修饰后作为靶向药物应用在不同类型细胞，Liu等[3]就曾用修饰后的GO作为抗癌药物的载体进行抗直肠癌细胞。王洁等[4]综合考察了GO对大鼠的干细胞活性。Yang等[5]研制出了多重靶向的GO阿霉素药物体系，用于抗乳腺癌细胞。作为新型的医药纳米材料GO对肿瘤细胞的研究较多，但GO衍生物的对正常细胞活性的评价并没有很多的报道，本实验通过石墨烯衍生物(L型衍生物GO-L和D型衍生物GO-D)对L6肌肉细胞生长成熟状况、细胞增殖活性和细胞因子的分泌三方面综合考察，探讨石墨烯衍生物对L6肌肉细胞分化成熟过程中的影响，为将来石墨烯衍生物在肾病糖尿病等疾病的诊断和治疗中的应用提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试药手性修饰的GO衍生物由武汉理工大学分子材料实验室友情提供。小鼠原代L6细胞均购自武汉细胞保存中心，台盼蓝、BSS液、小牛血清和DMEM-F12培养液购自GIBCO公司，实验室自行配制使用。胰蛋白酶、MTT购自上海博谷生物科技有限公司。培养瓶、96孔培养板、6孔培养板和细胞培养用的吸头购自美国Costar公司。二甲基亚砜购自Sigma公司。

1.2 仪器湖南湘仪台式高速冷冻离心机，苏州净化二级生物安全柜BHC-1300IIB2，上海三申医疗压力蒸汽灭菌器，美国ThermoFisher贺利氏CO2培养箱，美国伯乐DNM-9602型酶标仪，日本OLYMPUS CKX41倒置生物显微镜及OLYMPUS 1X74倒置荧光显微镜。

1.3 方法

1.3.1 L6细胞的培养[6]原代L6细胞按105个细胞/孔分别加入6孔板，用DMEM-F12培养液置37℃、5%CO2培养箱中进行培养，培养液中含10%胎牛血清和双抗(100U/m L青霉素和100mg/m L硫酸链霉素)，细胞生长至整个瓶底面积的80%时进行实验。

1.3.2 MTT法检测细胞活性[7]在96孔培养板中，分别加入0.3μg/m L浓度GO-L或GO-D液并按105个细胞/孔进行混合培养66 h后加20μLMTT溶液继续培养4 h，再加入150μL二甲基亚砜振荡10m in， 490 nm处测吸光度(opticaldensity，OD)值。

1.3.3 细胞因子的测定TNF-α(或INF-γ)的检测按说明书进行。取包被抗单克隆抗体于96孔酶标板，加入100μL细胞培养上清或已知浓度的标准抗体，37℃孵育50m in，洗3次。再加入100μL酶标抗抗体继续孵育1 h，洗涤后加入等量底物液，室温孵避光15m in，加入终止液。450 nm测定光密度值，绘制标准曲线，计算样本细胞因子水平。

1.4 统计学方法应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。不同手性GO组与对照组的差异或不同手性GO组之间的差异采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 L6细胞生长的观察图1是L6细胞的原代细胞与成熟L6细胞的生长状况对比，从图片可以看出，原代L6细胞大多呈梭形或不规则多边形，紧贴于培养瓶底部发生延性生长，培养3 d后，成熟L6细胞较原代细胞数量有所增加，没有成团生长的细胞且达到培养瓶底部平面的80%以上，单个L6细胞可以边界清晰以梭形为主，立体感强，细胞核小且细胞内出现肌性结构。

图1 L6细胞的生长对比

2.2 GO衍生物对L6细胞活性的影响图2所示，0.3μg/m LGO衍生物能促进L6细胞增殖，GO-L增殖活性[n=20，OD=(0.52±0.28)]低于GO-D[n=20，OD= (0.81±0.34)]，两者差异有统计学意义(F=4.54，P＜0.05)。GO-L和GO-D增殖活性与对照组[n=20，OD=(0.18±0.06)]比较差异有显著统计学意义(F= 6.05，P＜0.01)。

2.3 GO衍生物对L6肌肉细胞释放细胞因子的影响图3A显示(n=20)，GO衍生物能诱导L6肌肉细胞释放TNF-α，其中D型衍生物TNF-α的表达水平(24.9±8.86)强于L型衍生物TNF-α的表达水平(18.6±5.36)，两者差异有统计学意义(F=4.82，P＜0.05)。图3B(n=20)显示，GO衍生物能诱导L6肌肉细胞分泌少量IFN-γ，L型衍生物IFN-γ(14.3±3.78)和D型衍生物IFN-γ的表达水平(13.8±2.62)差异无统计学意义(F=0.82，P＞0.05)，但对于对照组IFN-γ的表达水平(2.1±0.72)差异有统计学意义(F=5.64，P＜0.05)。

图2 0.3μg/m L的GO衍生物对L6细胞生长活性的测定

图3 0.3μg/m L的GO衍生物对L6细胞因子产生的影响

3 讨论

GO衍生物是单原子结构，因其表面积大，很早就被作为药物载体开发[8]。杨永岗等[9]通过GO的细胞毒性研究发现，GO浓度降至100μg/m L时，对细胞毒性较低，40μg/m L浓度的GO对细胞仅有少许毒性，且细胞具有可逆性的恢复。本实验所用的GO浓度为0.3μg/m L，结果显示，GO衍生物对于原代L6肌肉细胞的增殖成熟有积极作用，GO衍生物(GO-L和GO-D)能促进成熟的L6肌肉细胞增殖活性，并且L型GO要弱于D型的作用。这可能与细胞在贴壁生长时，GO衍生物充当了其支撑物的空间结构有关。

近年来的研究证明骨骼肌具有分泌细胞因子的功能[10]，其中TNF-α、IL-18和IL-6在参与骨骼肌能源物质代谢、修复与合成的调控作用[11]。本实验结果显示，GO烯衍生物能诱导成熟的L6肌肉细胞分泌TNF-α和少量IFN-γ，D型衍生物对L6肌肉细胞释放TNF-α作用较强。由于L6肌肉细胞被广泛应用于糖尿病中胰岛素抵抗细胞模型机理的研究[12-14]，因此，TNF-α的释放可能与L6肌肉细胞糖代谢相关[15]。

IFN-γ在肌肉细胞中的作用尚未见报道，本次实验也没有对L6肌肉细胞中调控IFN-γ的蛋白作进一步研究，因此，L6肌肉细胞分泌少量IFN-γ的作用也不清楚。今后，将会对细胞因子相关蛋白的信号途径作深入研究，从而揭示GO衍生物在疾病研究中的新应用。

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Effect of graphene oxide derivatives on the activity of L6 cells.

YU Fu-heng1,LIZhong-juan1,2,CHEN Min2,CAI Xiao-kang2,LIAO Jin-qi2,TAN Ya-Ling2.1.Huangshi Oriental Community Service Center,Huangshi 435000,Hubei, CHINA;2.SchoolofMedicine,HubeiPolytechnic University,Huangshi435003,Hubei,CHINA

Objective To investigate the effectof graphene oxide(GO)derivatives on the activity of L6 cells. M ethods Morphologies of primary L6 cells,which had been cultured for 1 day or 3 days,and the cellmorphology were observed w ith inverted fluorescentmicroscope and saved as electronic graphics.Mature L6 cells in logarithmic phasewere collected.Cellproliferation activity was detected by MTT assay.Mature L6 cells in logarithm ic phase stimulated w ith GO derivatives had been cultured for 3 days,then cell culture supernatantswere collected.The serum tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interferon gamma(INF-γ)levelswere determined by ELISA.Results Over 80% of primary L6 cells had been cultured for 3 days differentiated into mature ones.0.3μg/m L GO derivatives(GO-L and GO-D)were stimulated by 3 d.OD value for cell proliferation stimulated by GO-L and GO-D was(0.52±0.28),(0.81±0.34),respectively.Both had significant differences compared w ith OD value for control cells[(0.18±0.06),F= 6.05,P＜0.01].Activity of GO-D on L6 cells proliferation was significantly higher than GO-L(F=4.54,P＜0.05).Both GO-L and GO-D could induce L6 cells to secrete TNF-α[(18.6±5.36)and(24.9±8.86)respectively]and a smallamount of IFN-γ[(13.8±2.62)and(14.3±3.78)respectively].But therewere no significant differences in IFN-γbetween the GO-L and GO-D(F=0.82,P＞0.05).Conclusion GO derivatives can induce L6 cellactivation and secretion of TNF-α, both ofwhichmay affect themetabolism and regulation of sugar in L6 cells.

Graphene oxide derivatives;Cell proliferation;Tumor necrosis factor alpha(TNF-α);Interferon gamma(IFN-γ)

R730.3

A

1003—6350（2016）16—2583—03

2016-03-03)

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.16.002

湖北省科技项目(编号：2011Cdc116)；湖北省黄石市科技项目(编号：黄科农[2012]1号)；教育部留学生启动资金(编号：46-2)

李仲娟。E-mail：1525677891@qq.com