融合蛋白LTβR-Fc对卵清蛋白诱发的皮炎小鼠模型的影响

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陆一枫 叶丽彩 钱齐宏

215006苏州大学附属第一医院皮肤性病科

·论著·

融合蛋白LTβR-Fc对卵清蛋白诱发的皮炎小鼠模型的影响

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陆一枫 叶丽彩 钱齐宏

215006苏州大学附属第一医院皮肤性病科

目的 探讨单纯疱疹病毒侵入介质配体信号通路LIGHT-HVEM阻断剂LTβR-Fc融合蛋白对卵清蛋白诱发的特应性皮炎小鼠模型的影响。方法 将BALB/c小鼠随机分为空白对照组（以100 μl生理氯化钠溶液进行刺激）、模型组（将100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化钠溶液中进行刺激）以及阻断剂组（在卵清蛋白致敏前24 h将100 μg LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化钠溶液作为阻断剂进行刺激），在开始致敏后第0、4、8、12、15、20、23、27、31、34天分别对各组实验小鼠进行病情严重程度评分，同时测量记录皮损面积大小，最后于造模结束时行眼眶取血并提取血清，处死各组小鼠，首先分别采用RT-PCR法和ELISA法检测小鼠皮损和脾细胞上清液内干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4和IL-5的mRNA和蛋白的表达情况，随后采用ELISA方法检测血清内卵清蛋白特异性以及总IgE和IgG1的表达水平。结果 LTβR-Fc显著抑制了卵清蛋白诱发的皮炎小鼠模型的炎症反应。与模型组相比，阻断剂组小鼠皮损面积显著减少（P<0.05），湿疹面积与严重度指数（EASI）评分降低（P<0.05）。皮炎小鼠模型组与阻断剂组小鼠皮损处IL-4 mRNA（1.81±0.25比0.88±0.25，P<0.05）、IL-5 mRNA（1.24± 0.26比 0.75± 0.15，P<0.05）、IFN-γ mRNA（1.11± 0.19比 0.62 ± 0.09，P<0.05）水平差异均有统计学意义，脾细胞上清液中IL-4蛋白（20.12±5.39比9.58±1.44，P<0.05）、IL-5蛋白［（22.77±4.07）ng/L 比（11.37 ± 2.02）ng/L，P<0.05）］、IFN-γ 蛋白［（23 930 ± 44.20）ng/L 比（16167 ± 950.40）ng/L，P<0.05）］水平差异亦具有统计学意义。经LTβR-Fc处理后，特应性皮炎小鼠模型血清内总IgE和卵清蛋白特异性IgE水平较模型组显著下降，IgG1的表达均显著下调。结论 融合蛋白LTβR-Fc可通过阻断LIGHT-HVEM信号通路显著缓解卵清蛋白诱发的皮炎小鼠的临床症状，提示LIGHT-HVEM信号通路可作为治疗皮炎（特应性皮炎）的潜在靶点。

皮炎，特应性；模型，动物；卵白蛋白；T淋巴细胞，辅助诱导；白细胞介素类；干扰素γ；LIGHTHVEM信号通路

特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，T细胞的过度激活在其发病机制中扮演重要角色。在AD的急性期以Th2型细胞为主，而在AD的慢性期则以Th1型细胞为主［1］。T细胞的激活主要是通过T细胞受体（TCR）和主要组织相容性复合体、辅助分子或共刺激分子的结合实现，因此，共刺激分子受体-配体结合在T细胞的激活、增殖、分化和凋亡过程中扮演着重要角色［2］。针对共刺激分子受体-配体结合的治疗策略不仅可用于预防急性移植免疫排斥，还可以用于维持自身免疫抑制［3］，对变应性、炎症性皮肤病的治疗同样具有重要的临床意义。单纯疱疹病毒侵入介质配体（LIGHT，或称TNFSF14，HVEML）是近期发现的肿瘤坏死因子（TNF）配体超家族的成员之一，参与许多炎症性疾病的发病进程，其受体为单纯疱疹病毒侵入介质（HVEM，也可称为 TNFRSF14 或 LIGHTR）［4］，主要表达在激活的T细胞上。研究表明，LIGHT参与类风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及炎症性肠病的发病进程，可望成为上述疾病新的治疗靶点［5-6］。AD患者外周血血清中LIGHT的表达水平较正常健康对照者显著上调，且与患者血清内IgE水平和湿疹面积与严重度指数（eczema area and severity index，EASI） 评分显著相关［7］。我们拟通过观察LIGHT-HVEM信号通路阻断剂对卵清蛋白诱发的皮炎小鼠的影响，进一步研究LIGHT在AD发病机制中的作用，为LIGHT-HVEM信号通路作为AD的治疗靶点提供理论支持。

材料和方法

一、实验动物及材料

BALB/c小鼠（6～8周龄，雌性，合格证号：2013001801706）来自上海斯莱克实验动物有限公司，卵清蛋白（V级）产自美国Sigma公司，斑试器产自北京百亿怡达科技开发有限公司，融合蛋白LTβR-Fc产自美国Bethyl公司，RNA抽提试剂盒产自上海捷瑞生物工程有限公司，抗鼠IgG1、IgG2a和IgE单克隆抗体产自英国Abcam公司，小鼠干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-4和 IL-5酶联免疫检测试剂盒（ELISA Kit）产自南京凯基生物科技发展有限公司，小鼠血清IgE和IgG1 ELISA试剂盒产自北京百奥莱博科技有限公司，RPMI 1640细胞培养基和胎牛血清均产自美国Gibco BRL公司，IFN-γ、IL-4和IL-5引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，细胞培养板均产自美国Becton Dickinson公司。

二、AD小鼠模型的建立和干预

于SPF级别环境下饲养BALB/c小鼠，12 h日夜更替，室温24～25℃，湿度5%～10%，自由进食。30只小鼠，随机分成3组，每组10只。实验设空白对照组、模型组以及阻断剂组，实验前24 h剔除小鼠背部毛发，胶带在除毛部位反复粘贴8次。空白对照组：以100 μl生理氯化钠溶液进行刺激；模型组：将100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化钠溶液中进行刺激；阻断剂组：在每次卵清蛋白致敏前以及更换斑试器前24 h，预先以100 μg阻断剂LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化钠溶液预处理小鼠。刺激与预处理过程除所用溶液成分不同外，其余步骤相同。将含不同成分的生理氯化钠溶液滴在8 mm大圆形斑试器中的滤纸片上,随后将斑试器用绷带固定于背部，每2～3 d更换斑试器，1周后取下，间隔2周重复1次上述致敏和阻断过程，共致敏3次，计7周。采用EASI方法每周进行临床评分，评分标准：轻度（0～24分），中度（25～50分）和重度（51～ 103分）［7］。造模结束后，在 24 h内处死小鼠，按照实验要求切取皮损，冻于液氮内；于超净台内摘取脾脏，制成单细胞悬液。

三、RT-PCR法检测皮损处IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表达

按照RNA抽提试剂盒说明书抽提皮损标本总RNA，配制逆转录反应液，建立20 μl反应体系，用DNA扩增仪进行逆转录合成cDNA，采用荧光实时定量PCR检测IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表达（以GAPDH为内参照），引物以及PCR反应条件均参考既往文献［8-9］设计，反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以验证产物的特异性，另将反应产物行琼脂糖凝胶电泳再次确认所扩增DNA片段的单一性。由系统自动生成试验数据，采用2-△△Ct法进行数据分析，以2-△△Ct值代表相应细胞因子mRNA的表达量。每例标本设3个复孔。

四、ELISA检测小鼠血清中总IgE和IgG1的表达水平

按照试剂盒说明书检测小鼠血清中总IgE和IgG1以及卵清蛋白特异性IgE和IgG1的表达水平。根据标准曲线直线回归方程以及样本450 nm处吸光度A值，计算样本实际浓度。

五、ELISA法检测IL-4、IL-5和IFN-γ蛋白表达水平

分离空白对照组、模型组以及阻断剂组小鼠脾脏，分别制成脾脏单细胞悬液重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640溶液内，以2×106/ml细胞密度种在24孔板内（预先以抗CD3单克隆抗体包被，1 mg/L），孵育6 h后离心收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测IL-4、IL-5和IFN-γ水平。

六、数据分析

用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析。计量资料的数据以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析法（one-way ANOVA），Bonferroni检验进行多重比较，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、LTβR-Fc显著抑制皮炎小鼠皮肤炎症反应

造模结束后，肉眼观察模型组和阻断剂组小鼠背部接触斑试器部位皮肤均出现不同程度炎症反应，表现为红斑、鳞屑以及少许结痂。模型组红斑和鳞屑表现较阻断剂组严重，空白对照组未见明显皮损（图1）。与模型组相比，阻断剂组皮损面积在开始致敏后第27、31以及34天显著降低（均P<0.05，图 2），EASI评分在第 23、27、31 天显著降低（均 P<0.05，图 3）。

图1 各组小鼠开始致敏后第34天皮肤表现 每组3只小鼠。模型组小鼠背部接触斑试器部位皮肤均出现明显的炎症反应，表现为红斑、鳞屑以及少许结痂，而阻断剂组红斑和鳞屑较模型组明显减轻，空白对照组未见明显皮损

图2 各组小鼠皮损面积随时间变化比较 a：模型组与阻断剂组比较，P<0.05

图3 各组小鼠湿疹面积与严重度指数（EASI）评分随时间变化比较a：模型组与阻断剂组比较，P<0.05

表1 皮炎小鼠皮损处白细胞介素（IL）-4、IL-5和干扰素γ（IFN-γ）mRNA表达及脾细胞上清液内3种细胞因子蛋白表达水平（±s，ng/L）

表1 皮炎小鼠皮损处白细胞介素（IL）-4、IL-5和干扰素γ（IFN-γ）mRNA表达及脾细胞上清液内3种细胞因子蛋白表达水平（±s，ng/L）

注：n=10。a：与空白对照组比较，P<0.05；b：与阻断剂组比较，P<0.05

组别 皮损脾细胞上清液IL-4 mRNA IL-5 mRNA IFN-γ mRNA IL-4 IL-5 IFN-γ模型组 1.81±0.25ab 1.24±0.26ab 1.11±0.19ab 20.12±5.39ab 22.77±4.07ab 23 930±4 419.69ab阻断剂组 0.88±0.25a 0.75±0.15a 0.62±0.09a 9.58±1.44a 11.37±2.02a 16 166.67±950.40a空白对照组 0.51±0.07 0.47±0.03 0.37±0.11 3.93±1.72 5.01±0.69 130±17.09 F值 105.295 49.838 73.596 59.428 115.002 216.244 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

二、LTβR-Fc显著抑制皮炎小鼠皮损处和脾细胞上清液内IL-4、IL-5和IFN-γ表达

RT-PCR检测结果显示，与空白对照组相比，模型组皮损处 IL-4、IL-5、IFN-γ mRNA表达水平显著上调，而阻断剂组皮损处IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA的表达水平相对于模型组则显著下调（均P<0.05，表1）。与空白对照组相比，模型组脾细胞上清液内IL-4、IL-5和IFN-γ表达水平亦显著上调，而阻断剂组脾细胞上清液内上述3种细胞因子的表达水平相对于模型组亦显著下调（均 P<0.05，表 1）。

三、LTβR-Fc显著抑制皮炎小鼠血清内总IgE和IgG1以及卵清蛋白特异性总IgE和IgG1的表达

结果显示，与空白对照组相比，模型组血清内总IgE和IgG1的表达水平显著上调。阻断剂组血清内总IgE和IgG1的表达水平相对于模型组显著下调（均P<0.05，表2）。此外，与空白对照组相比，模型组血清内卵清蛋白特异性IgE和IgG1的表达水平亦显著上调，而阻断剂组相对于模型组则显著下调（均 P<0.05，表2）。

讨 论

表2 融合蛋白LTβR-Fc对卵清蛋白诱发的皮炎小鼠血清内总的和卵清蛋白特异性的IgE和IgG1表达的影响（±s，μg/L）

表2 融合蛋白LTβR-Fc对卵清蛋白诱发的皮炎小鼠血清内总的和卵清蛋白特异性的IgE和IgG1表达的影响（±s，μg/L）

注：n=10。a：与空白对照组比较，P<0.05；b：与阻断剂组比较，P<0.05

组别 总IgE 总IgG1 卵清蛋白特异性IgE卵清蛋白特异性IgG1模型组 32 277.00±407.53ab 2 323.33±502.43ab 0.84±0.11ab 0.86±0.07ab阻断剂组 27 446.67±2 052.64a 1 296.33±32.72a 0.46±0.10a 0.62±0.10a空白对照组 1 967.00±85.49 206.67±12.06 0 0 F值 1 813.699 132.510 234.224 393.095 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

本研究中我们发现，LTβR-Fc这一阻断LIGHT-HVEM信号通路的融合蛋白显著抑制了卵清蛋白诱发的皮炎小鼠模型的皮肤炎症反应，降低了其皮损面积以及EASI评分；此外，LTβR-Fc亦显著下调了皮炎小鼠模型皮损处和脾脏内IFN-γ、IL-4和IL-5的表达以及血清内卵清蛋白特异性和总IgE以及IgG1的表达水平。上述结果提示，LIGHT可以作为治疗皮炎，尤其是AD的潜在靶点。

以往研究表明，LIGHT不仅参与T细胞增殖和活化，还在抗原激活记忆性Th细胞的维持以及适应性免疫反应过程中发挥重要作用［10］。有研究者认为，以被抗原激活的T细胞为靶点的治疗策略对炎症性疾病是非常有效的［4］。近期有研究表明，阻断LIGHT-HVEM信号通路能显著抑制哮喘小鼠模型记忆性Th2细胞数量的上调，并与其炎症反应的下调显著相关［11］。此外，在嗜酸性食管炎患者中，LIGHT和HVEM的表达显著上调，并可能通过转化生长因子β依赖机制导致组织坏死［12］。而小鼠模型实验结果显示，阻断或清除LIGHT-HVEM信号通路可导致小鼠对利什曼虫感染易感性上升，表明LIGHT-HVEM信号通路在树突细胞以及淋巴细胞介导的免疫反应中起重要作用［13］。我们的研究表明，以融合蛋白LTβR-Fc阻断LIGHT-HVEM信号通路显著抑制卵清蛋白诱发的皮炎小鼠模型的皮肤炎症反应。我们的发现为共刺激分子网络信号通路以及蛋白类药物在变应性、炎症性疾病中作为研发靶点提供了新的依据。

除了患者皮损面积以及EASI评分之外，Th1和Th2细胞因子表达失衡，患者血清内IgE和IgG1的表达上调也是AD患者常见的表现［14］。目前研究发现，在AD小鼠模型中，IL-4可诱导B细胞产生合成IgE，募集嗜酸性粒细胞至皮损处；IL-5是嗜酸性粒细胞分化和激活的必要条件之一；而IFN-γ则在AD慢性期的炎症反应中发挥重要作用［15］。我们的研究结果显示，LTβR-Fc显著抑制皮炎小鼠模型皮损处和脾脏内IFN-γ、IL-4和IL-5的表达，并下调血清内IgE和IgG1的表达。

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Effects of a fusion protein LTβR-Fc on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model

Fang Fumin,Jiao Qingqing,Zhu Tingting,Lu Yifeng,Ye Licai,Qian Qihong

Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To evaluate effects of a fusion protein LTβR-Fc,which can block the herpesvirus entry mediator ligand（LIGHT-HVEM）signaling pathway,on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model.Methods Thirty BALB/c mice were randomly and equally divided into 3 groups:blank control group treated with 100 μl of sodium chloride physiological solution,model group sensitized with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin,blocker group firstly blocked with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg LTβR-Fc followed by sensitization with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin at 24 hours after the blocking.Disease severity was evaluated by eczema area and severity index（EASI）score,and lesional size was measured on day 0,4,8,12,15,20,23,27,31 and 34 after the first sensitization.A total of three sessions of sensitization were carried out.At the end of treatment,all the mice were sacrificed after serum was obtained from their orbital cavities.Thereafter,tissue specimens were obtained from skin lesions,and single cell suspensions of the spleen were prepared.RT-PCR was performed to detect mRNA expressions of interferon γ （IFN-γ）,interleukin 4 （IL-4）and IL-5 in murine lesions,ELISA to measure IFN-γ,IL-4 and IL-5 levels in culture supernatants of murine splenocytes,as well as ovalbumin-specific and total IgE and IgG1 levels in murine sera.Results LTβR-Fc significantly suppressed inflammatory response in the mouse model of dermatitis induced by ovalbumin.Compared with the model group,the blocker group showed significantly decreased lesion area and EASI score （bothP<0.05）.In addition,a significant decrease was observed in the mRNA expressions of IL-4（0.88±0.25 vs.1.81±0.25,P＜0.05）,IL-5（0.75±0.15 vs.1.24±0.26,P＜0.05）and IFN-γ （0.62±0.09 vs.1.11±0.19,P＜0.05）in murine lesions,and in supernatant levels of IL-4（9.58±1.44 ng/L vs.20.12±5.39 ng/L,P＜0.05）,IL-5（11.37±2.02 ng/L vs.22.77±4.07 ng/L,P＜0.05）and IFN-γ （16 167±950.40 ng/L vs.23 930±44.20 ng/L,P＜0.05）in the blocker group compared with the model group.The serum levels of both total IgE and ovalbumin-specific IgE were significantly lower in the blocker group than in the model group（total IgE:27 466.67 ± 2 052.64 μg/L vs.32 277 ± 407.53 μg/L,P ＜ 0.05;ovalbumin-specific IgE:1 296.33 ±32.72 μg/L vs.2 323.33 ± 502.43 μg/L,P ＜ 0.05）,so were those of total IgG1 （0.46 ± 0.11 μg/L vs.0.84 ± 0.11 μg/L,P ＜ 0.05）and ovalbumin-specific IgG1 （0.62 ± 0.11 μg/L vs.0.86 ± 0.07 μg/L,P ＜ 0.05）.Conclusion The fusion protein LTβR-Fc can alleviate symptoms of ovalbumin-induced dermatitis in the mouse model likely by suppressing the LIGHT-HVEM signaling pathway,suggesting that this signaling pathway may serve as a target for the treatment of dermatitis（such as atopic dermatitis）.

Dermatitis,atopic;Models,animal;Ovalbumin;T-lymphocytes,helper-inducer;Interleukins;Interferongamma;LIGHT-HVEM

Qian Qihong,Email:qqihong@126.com

钱齐宏，Email：qqihong@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.010

国家自然科学基金（81402597）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81402597）

2015-04-04）

（本文编辑：尚淑贤）