长岛型掌跖角化病二例SERPINB7基因突变研究

多丽娜 汪慧君 林志淼 杨勇

100034北京大学第一医院皮肤科

·论著·

长岛型掌跖角化病二例SERPINB7基因突变研究

多丽娜 汪慧君 林志淼 杨勇

100034北京大学第一医院皮肤科

目的 报告2例长岛型掌跖角化病，确定其致病基因突变。方法 收集患者及其父母外周血和临床资料，提取基因组DNA，PCR扩增SERPINB7基因8个外显子及其侧翼序列，对扩增产物进行DNA测序以查找基因突变位点，并以200例无关健康人DNA作为对照进行扩增测序。结果 2例患者均存在SERPINB7基因c.796C>T纯合突变，导致编码蛋白质第266位氨基酸出现终止改变（p.R266*），其父母均为c.796C>T杂合突变，而无关健康对照未发现上述突变。结论 SERPINB7基因的c.796C>T突变可能是引起2例患者长岛型掌跖角化病的原因。

皮肤角化病，掌跖；皮肤表现；DNA突变分析；基因，SERPINB7；长岛型掌跖角化病

掌跖角化病（palmoplantar keratoderma,PPK）是一组复杂的以掌跖皮肤肥厚和过度角化为主要特征的先天性遗传病，包括数十种不同亚型［1］。长岛型掌跖角化病（Nagashima-type palmoplantar keratosis,NPPK,OMIM 615598）属于弥漫性非残毁性掌跖角化病，是一种常染色体隐性遗传病。最近，Kubo等［2］确定NPPK的致病基因为编码丝氨酸蛋白酶抑制因子B亚型7的SERPINB7基因。目前已报道的NPPK患者主要来自日本，我们在临床上收集到2例中国NPPK患者，并检测其SERPINB7基因突变情况。

对象与方法

一、临床资料

2例患者均为散发病例。例1女，24岁，出生时即出现掌跖部红斑、脱屑，并逐渐加重扩展，累及手、足背部，伴轻度手、足多汗，反复出现趾间真菌感染。例2女，25岁，出生时出现掌跖部皮肤潮红、角化，后出现皮肤增厚、脱屑，逐渐加重并进展至手、足背部，伴有轻度手、足多汗及反复足癣、甲癣病史。体检：2例患者均可见双手掌、足底、指趾背部、手足背边缘、指趾背侧面、手腕内侧、踝及跟腱处有弥漫性红斑伴角化及脱屑，角化处皮肤呈轻度增厚，角质层略呈淡黄色，部分区域因多汗出现浸渍发白。例2肘部及膝部可见轻度红斑及角化，足部数个趾甲远端变脆、分离，真菌镜检呈阳性。2例患者手、足浸水数分钟后角质层均发生明显变白伴轻度肿胀（图1）。2例患者均未见毛发或牙齿异常。否认家族史及父母近亲婚育史。2例患者采用10%尿素和5%水杨酸软膏外用，皮疹轻度缓解，停药后很快复发。

二、实验方法

1.外周血基因组DNA提取：本研究经北京大学第一医院伦理委员会同意，患者及其家属签署知情同意书。取患者、父母和200例健康对照者的外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用试剂盒提取基因组DNA（产自北京天根生化科技有限公司）。

2.PCR引物设计和合成：根据SERPINB7基因序列（来源于Ensembl网站，网址：http://www.ensembl.org/index.html），利用 Primer-BLAST 在线版（网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计8对特异性引物，覆盖SERPINB7基因8个外显子及其侧翼序列，引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

3.PCR反应体系及条件：PCR反应体系25μl，含基因组 DNA50ng，dNTPs0.4mmol/L，MgCl22.0mmol/L，上下游引物各10 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR反应条件：95℃预变性5 min后，94℃变性30 s，62℃退火30 s（每个循环依次降0.5℃），72℃延伸 45 s，10个循环；94℃变性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸9min，4℃保存。取5 μl PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

4.PCR产物测序分析：所有PCR产物纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司测序，测序方法为Sanger双脱氧链终止法（Sanger法）。测序结果采用Bioedit软件与SERPINB7基因组序列进行比对。

结 果

以患者的基因组DNA为模板，所有引物的PCR产物经凝胶电泳均可见目标条带，产物切胶纯化后测序，结果清晰无杂峰干扰。将所测得的序列与 Ensembl数据库（http://www.ensembl.org/index.html）公布的正常序列进行对比，得到如下结果：2例患者SERPINB7基因第8外显子中第796位核苷酸（从cDNA编码起始位点ATG算起）发生C→T纯合突变（c.796C>T）（dbSNP:rs142859678），导致其编码蛋白质在第266位氨基酸出现终止改变（p.R266*），其父母均为c.796C>T突变携带者（图2），无关正常对照未发现此突变。所有突变均由反向测序得到验证。

图1 患者皮损表现 1A：例1手背与手掌交界处红斑角化；1B：例2足背、足踝、跟腱处弥漫性红斑及角化，部分趾甲变脆、增厚及远端分离；1C：例2肘部轻度红斑及角化；1D：例2双手掌弥漫性红斑及角化，略呈淡黄色，遇水后角质层发白，轻度肿胀（右手）

图2 SERPINB7基因突变测序图（箭头指示突变位点） 2A：患者SERPINB7基因c.796C>T纯合突变；2B：患者父母携带c.796C>T杂合突变；2C：无关正常对照测序结果

讨 论

NPPK通常表现为出生时至3岁以内出现掌跖部位弥漫性红斑及角化，可累及手足背部、腕内侧、踝和跟腱部位，遇水后角化皮肤可出现发白改变［3-4］。皮疹稳定，不随年龄增长出现明显进展或加重。患者常伴有手掌和足底多汗，易伴发皮肤浅表真菌感染［3］。NPPK需要与Mal de Meleda掌跖角化病、Bothnia型掌跖角化病鉴别。Mal de Meleda同样为常染色体隐性遗传，但其掌跖角化为进展性，随年龄增长逐渐加重，且角化通常更为严重，多伴有甲受累及口周、肛周的红斑角化［4］；而Bothnia型掌跖角化病为常染色体显性遗传，尽管临床表现与NPPK较为类似，但是Bothnia掌跖角化通常多汗更为严重，可伴有轻度甲改变，而且遇水后角质发白及肿胀更迅速且更明显［5-6］。

最近，Kubo等［2］对3例无关日本NPPK患者进行全外显子组测序分析，确定NPPK的致病基因为SERPINB7基因。通过Sanger测序，进一步分析另外10例无关NPPK患者的SERPINB7基因外显子序列，最终发现这13例患者中6例患者存在SERPINB7的c.796C＞T纯合突变，另外7例患者为c.796C＞T杂合突变伴其他功能缺失性杂合突变。该作者通过千人基因组数据库（1 000 Genomes Project）中SERPINB7基因突变位点的分布情况分析，发现c.796C＞T（rs142859678）杂合突变在日本和中国的正常人群中携带频率分别为2/89和6/197，然而该突变位点未见于千人基因组数据库中欧洲及其他非洲裔的正常人群。因此推断，NPPK可能主要流行于亚洲，特别是日本和中国。SERPINB7基因编码丝氨酸蛋白酶抑制因子B亚型7，具有抑制丝氨酸蛋白酶的作用，可保护细胞免于蛋白酶介导的损伤［7］。SERPINB7分布于全身表皮，表达于颗粒层及角质层［8］。SERPINB7的酶触反应中心位于第331～352位氨基酸，保持核心功能区的完整性是维持酶活性的基本条件［9］，因此发生于该催化区域之前的截短突变可以导致NPPK患者表皮内颗粒层和角质层SERPINB7蛋白酶活性抑制作用丧失，表皮内SERPINB7的减少可使丝氨酸蛋白酶活性增强，导致角质形成细胞蛋白降解合并角质层结构破坏，加速水分渗透到角质层，从而引发一系列临床表现［2］。

本研究组近期检测了7例中国汉族NPPK患者的SERPINB7基因突变情况，发现4例患者带有c.796C＞T纯合突变，2例患者为c.796C＞T杂合突变同时伴其他功能缺失性杂合突变，1例患者为c.522-523insT纯合突变，提示SERPINB7基因的c.796C＞T突变很可能是中国汉族NPPK患者最常见的致病性突变位点［10］。本研究中2例NPPK散发患者均为SERPINB7基因c.796C＞T纯合突变所致，确定该突变位点可能是中国人NPPK最常见的突变位点。先前的研究证实，c.796C＞T突变存在祖先效应（founder effect），即该位点很可能来源于中国汉族的某一共同祖先［10］，这对该病的快速诊断有非常重要的意义。由于正常汉族人群携带该杂合突变位点的比例高达3%，因此，在中国NPPK很可能是最常见的常染色体隐性遗传性掌跖角化病之一。临床上散发的、非残毁性、弥漫性掌跖角化病患者需考虑NPPK的诊断，在进行基因检测确诊时，可以优先检测SERPINB7基因c.796C＞T突变位点。此外，由于正常人群中携带SERPINB7基因致病性突变位点比率较高，因此进行遗传咨询时，应建议患者配偶也进行相应基因携带情况的排查。

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Mutation analysis of the SERPINB7 gene in two patients with Nagashima-type palmoplantar keratoderma

Duo Lina,Wang Huijun,Lin Zhimiao,Yang Yong

Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

Objective To report two cases of Nagashima-type palmoplantar keratoderma（NPPK）,and to identify mutations in the SERPINB7 gene.Methods Clinical data were collected from two patients with NPPK and their parents,and peripheral blood samples were obtained from the two patients,their parents and 200 unrelated healthy controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing.Results A homozygous mutation （c.796C>T）,which led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 266 （p.R266*）,was identified in both of the two patients.However,the patients′healthy parents were heterozygous carriers of the mutation（c.796C>T）.No mutation was found in the unrelated healthy controls.Conclusion The mutation c.796C>T in the SERPINB7 gene may be responsible for NPPK in the two patients.

Keratoderma,palmoplantar;Skin manifestations；DNA mutational analysis;Genes,SERPINB7;Nagashima-type palmoplantar keratosis

Lin Zhimiao,Email:zhimiaolin@bjmu.edu.cn

林志淼，Email：zhimiaolin@bjmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.007

北京市高等学校青年英才计划项目（YETP0069）

Fund program:Beijing Higher Education Young Elite Teacher Project（YETP0069）

2015-05-04）

（本文编辑：尚淑贤）