五倍体草莓及其十倍体的叶片差异表达蛋白分析

宁传丽，蔡斌华，王　涛，乔玉山

(南京农业大学 园艺学院， 南京210095)



五倍体草莓及其十倍体的叶片差异表达蛋白分析

宁传丽，蔡斌华，王涛，乔玉山*

(南京农业大学 园艺学院， 南京210095)

以二倍体绿色草莓(FragariaviridisDuch.)为父本、八倍体栽培草莓‘房香’(F. ×ananassa‘Fusanoka’)为母本杂交所得的五倍体草莓(株系代号：FxLs-11-37，2n=5x=35)及其染色体加倍而成的十倍体(株系代号：A3，2n=10x=70)草莓为试材，观察记载其部分农艺性状、SPAD值以及净光合速率，利用双向凝胶电泳技术对草莓染色体加倍后叶片蛋白质进行了分析，获得了分辨率高、重复性好的电泳图谱。结果表明：(1)与五倍体FxLs-11-37相比，十倍体A3的株型明显矮化、植株冠径变大、叶长叶宽增大、叶片增厚以及叶色浓绿，其叶片的SPAD值与净光合速率显著高于FxLs-11-37。(2)通过PDQuest软件对图谱分析表明，两者在等电点4～7、分子量14.4～66.2 kD范围内蛋白质斑点分布最多，可识别的总蛋白质斑点数超过700个，其中蛋白质表达差异水平在1.5倍以上的有18个，2.0倍以上的有4个。利用MALDI-TOF-MS/MS质谱技术鉴定了这4个差异蛋白质，分别是草莓主要过敏原a 1-E、核内不均一核糖核蛋白1、叶绿体硫辛酰基合酶1、NAD(P)H 脱氢酶(醌)FQR1类似蛋白质。这些差异蛋白质主要与抗逆、mRNA转运、物质与能量代谢相关。荧光定量PCR对上述4个蛋白编码基因的转录表达水平检测表明，与蛋白质表达差异的趋势一致。该研究获得了草莓染色体加倍后差异表达的蛋白质，为深入研究提供了线索。

草莓；五倍体；染色体加倍；差异蛋白质

草莓属(FragariaDuch.)植物染色体基数x=7，倍性水平丰富，主要有二倍体(2x=14)、四倍体(4x=28)、八倍体(8x=56)等类型。人工杂交获得的草莓属多样性倍性资源[1-2]，为草莓倍性育种奠定了基础，也为多倍体形成机制研究提供了宝贵资源。随着倍性的改变，植物基因组的结构和基因的表达会发生一系列的变化，如染色体重组、基因沉默、基因的非加性表达等[3-4]。植物多倍体的表型常表现出植株粗壮、节间变短、叶色更深[5]、生长缓慢、开花推迟[6-7]及抗性增强[8]等特征，这些变化归根结底是蛋白质表达的结果[9-10]。

蛋白质组学为蛋白水平上的差异研究提供了新技术，在植物研究中的应用越来越广泛，如雄性不育[11]、抗病抗逆研究[12]等。植物多倍化的蛋白质组学方面的研究已有不少报道，涉及木薯[13]、拟南芥[14]、香蕉[15]、甘蓝[16]、棉花[17]、马铃薯[18]和小麦[19-20]等。虽然草莓是较早开展蛋白质表达谱研究的果树种类之一[21]，但有关草莓属植物多倍体蛋白质组学的相关研究尚属空白。本研究采用双向电泳技术进行蛋白质组学分析，探寻草莓五倍体种间杂种与染色体加倍后蛋白质表达谱的差异，并对差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定，进一步丰富草莓染色体加倍的分子生物学机制。

1　材料与方法

1.1实验材料

以二倍体绿色草莓(FragariaviridisDuch.)为父本、八倍体栽培草莓‘房香’(F. ×ananassa‘Fusanoka’)为母本种间杂交获得草莓实生苗，经染色体计数确认为五倍体的株系FxLs-11-37(2n=5x=35)为试材，用1.0 mg·L-1秋水仙素溶液浸泡茎尖48 h，获得经染色体基数确定为十倍体的株系A3(2n=10x=70)[22]。上述试材盆栽于南京农业大学牌楼实验基地，于6月上旬，选取长势整齐的植株，剪取靠近顶端生长点往外数第一张展开叶(复叶)的中心叶，液氮速冻后存于-70 ℃冰箱备用。

1.2 1农艺性状及SPAD(Soil plant analysis development)值测定随机选取长势旺盛且一致的FxLs-11-37与A3各10株，按照赵密珍等[23]的描述测量其株高、中心叶的叶长及叶宽以及植株冠径。采用SPAD-502 Plus便携式叶绿素测定仪分别测量成熟叶片和幼叶的SPAD值，测定标准为：幼叶测定靠近顶端生长点往外数第一张展开叶(复叶)的中心叶，成熟叶片测定靠近顶端生长点往外数第三张展开叶(复叶)的中心叶，计算平均值，方差分析采用SPSS 19.0。

1.2 2净光合速率的测定分别选取5株长势旺盛且一致的FxLs-11-37与A3，在阳光较好的天气，利用LP-6400型便携式光合仪测定靠近顶端生长点第三张展开叶(复叶)的中心叶在7：30、9：00、10:30、12:00、15:00、16:30与18:00等7个时间点的净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)，计算平均值，方差分析采用SPSS 19.0。

1.3蛋白质提取

采用TCA-丙酮沉淀法提取草莓叶片总蛋白质。分别称取约0.6 g样品液氮中研磨成粉，转至10 mL离心管，加入7 mL -20 ℃预冷的质量浓度为100 g·L-1TCA/丙酮(含0.07% DTT)，-20 ℃沉淀1.5 h后于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清；将沉淀重悬浮于-20 ℃预冷丙酮溶液(含0.07% DTT)，-20 ℃过夜，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清，重复此步骤直至上清液无色。将盛有沉淀的离心管用封口膜封口，扎孔，置于4 ℃冰箱干燥成蛋白质干粉。每1 mg蛋白质干粉加入10 μL的蛋白质裂解缓冲液4 ℃裂解3.5 h后于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液，重复该步骤1～2次至裂解缓冲液中无杂质。

表1　荧光定量PCR引物Table 1　Specific primers used in qPCR

1.4蛋白质质量浓度测定

草莓叶片总蛋白质量浓度测定采用Bradford[24]法：以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，测定其在595 nm波长下的吸光度A595，以不同质量浓度的BSA为横坐标，测得的吸光度A595为纵坐标，绘制标准曲线(R2≥0.99)，计算样品中蛋白质的含量。

1.5双向凝胶电泳

阿里衣服没穿，爬起来，先到桌前按了一下录音机的键，哀乐轰一声响起。阿里打开窗子，哀乐便如同被释放，从窗口涌了出去。

通过计算，取一定量含1.5 mg蛋白质的溶液加入裂解液至总体积为350 μL，沿IPG胶条槽缓慢均匀加入，将17 cm pH 4～7的IPG预制胶条胶面朝下覆盖在样品上，在胶面上覆盖少许矿物油，盖上盖子。将胶条槽放在IPGphor等电聚焦电泳仪中，设置等电聚焦程序：50 V水化13 h，250 V慢速升压1 h，500 V慢速升压1 h，1 000 V线性升压1 h，2 000 V线性升压1 h，10 000 V线性升压4 h，10 000 V快速聚焦使运行电压与时间的乘积达65 000 VH，完成蛋白等电聚焦分离，等电聚焦过程温度设为19 ℃。

等电聚焦结束后，立即进行胶条的平衡。将IPG胶条放于10 mL平衡缓冲液1中，在水平摇床上振荡15 min，取出IPG胶条冲洗，放入10 mL平衡缓冲液2中，水平摇床上振荡15 min。平衡结束后，将浸洗后的胶条转入体积浓度为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)板中进行第二向垂直电泳。电泳结束后，采用G-250胶体考染法染色8 h，超纯水脱色至背景清晰。上述电泳分析重复3次。

1.6凝胶扫描及质谱分析

使用Image Scanner扫描仪对染色后的凝胶进行扫描，获得蛋白质点图像，扫描模式为灰度模式，光密度值为300 dpi。采用PDQuest 8.0分析软件对扫描图像进行分析。与参考胶的蛋白质点表达量相比，选取1.5倍以上差异且统计学测验具有显著性差异的蛋白质点做为差异表达蛋白质点。

取2倍以上差异表达蛋白质点进行酶解，酶解方法参照Katayama等[25]的方法：将含有差异蛋白质点的胶块切下，重新溶解于5 μL含0.1% TFA的溶液中，然后按照1∶1的比例与含50% ACN和1% TFA的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液混合后，取1 μL样品用ABI5800串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF)(Applied Biosystems)进行质谱点靶鉴定。

1.7差异蛋白质相关基因的qRT-PCR分析

采用CTAB法分别提取FxLs-11-37及A3的幼嫩叶片样品总RNA，用核酸蛋白分析仪测量体积浓度并以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。总RNA为模板按照反转录试剂盒PrimescriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书反转录得到cDNA第一链。根据差异蛋白质对应的核苷酸序列，采用Beacon Designer 8.13软件设计实时荧光定量PCR引物(表1)。采用草莓Actin基因作为内标，以cDNA为模板对4种差异蛋白质的相关基因进行qPCR分析：20 μL反应体系包括SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)10 μL，正、反向引物分别为0.3 μL，稀释10×cDNA模板1 μL，超纯水8.4 μL；反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40个循环，重复3次，仪器为7300 Real Time PCR System实时荧光定量PCR仪。利用Excel 2007软件进行数据录入，使用2-ΔΔCt法，以FxLs-11-37为对照，进行差异蛋白质相关基因相对表达量分析。

2　结果与分析

2.1五倍体草莓染色体加倍后农艺性状、SPAD值和净光合速率的变化

与五倍体草莓株系FxLs-11-37比较，染色体加倍的株系A3农艺性状、SPAD值和净光合速率均发生了显著的变化。其中，十倍体株系A3表现出明显的株型矮化、植株冠径变大，叶宽增大以及叶长略增大、叶片略增厚以及叶色浓绿等性状特征(表2)；成熟叶片的SPAD值(48.29)明显高于FxLs-11-37(39.81)，其幼叶的SPAD值(33.83)略高于FxLs-11-37(30.53)(表3)；除18：00外，其余时段A3叶片的净光合速率比FxLs-11-37高(表3)。

2.2五倍体草莓与其十倍体草莓的差异蛋白分析

经PDQuestTM 2-D Analysis软件分析，3个重复都具有的点才被认为是确定的点，结果显示重复组的相似系数平均为73.5%，表明重复性较好。获得的染色体加倍前后叶片清晰且重复性较好的2-DE图谱(图1)，FxLs-11-37与A3蛋白质的分布模式图相似，总蛋白质点数均超过700个，集中分布在等电点4～7和分子量14.4～66.2 kD范围内。以表达量大于1.5倍为差异点，获得差异表达蛋白质点18个，A3表达上调的2个、下调的16个，其中表达量超过2倍的差异点有4个，编号依次为 8106、8515、8006、5121。经MALDI-TOF-MS/MS技术进行鉴定，这4个差异蛋白质是：草莓主要过敏原a1-E(major strawberry allergen Fra a1-E，8106)、核内不均一核糖核蛋白1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1，8515)、叶绿体硫辛酰基合酶1(lipoyl synthase 1，chloroplastic，8006)、NAD(P)H脱氢酶(醌)FQR1类似蛋白质(NAD(P)H dehydrogenase (quinone)FQR1-like，5121，表4)，这些差异蛋白质(点)是下一步需要分析的对象。

表2　五倍体草莓与其十倍体草莓的部分农艺性状Table 2　Some agronomic traits of FxLs-11-37 and A3

注：表中同列数据后不同的小写字母表示FxLs-11-37与A3间差异显著(P<0.05)，下同

Note: Different normal letters at the end of figure on the same column indicate significant differences (P<0.05). The same as below

表3　五倍体草莓与其十倍体草莓的SPAD值和净光合速率Table 3　SPAD reading and net photosynthetic rate of FxLs-11-37 and A3

黑色数字表示蛋白质表达差异水平在1.5～2.0倍的14个蛋白点；白色数字表示蛋白质表达差异水平在2.0倍以上的4个蛋白点；Mr为分子量Marker图1　五倍体草莓与其十倍体的叶片双向凝胶电泳图谱The 14 proteins whose expression levels had a 1.5-2.0 times change were marked in dark numbers, and the 4 proteins whose expression levels had more than 2.0 times change were marked in white numbers. Mr. Molecular weight markerFig.1　Two dimensional electrophoresis maps of FxLs-11-37 and A3 strawberry leaves表4　五倍体草莓与其十倍体的叶片差异蛋白质MALDI-TOF-TOF-MS-MS鉴定Table 4　Identification of differentially expressed proteins between the FxLs-11-37 and A3 strawberry leaves by MALDI-TOF-TOF-MS-MS

编号Spot理论分子量Molecularweight/kD等电点Isoelectricpoint得分Score肽片段覆盖率SC/%登录号Accessionno蛋白质名称Proteinname物种来源Sourceorganism8106177666.1352862CAJ85645.1草莓主要过敏原a1-EMajorstrawberryallergenFraa1-E栽培草莓F.×ananassa8515423536.5435325XP_004296398.1核内不均一核糖核蛋白1Heterogeneousnuclearribonucleo-protein1森林草莓F.vescasubsp.vesca8006399408.82411XP_011463424.1叶绿体硫辛酰基合酶1Lipoylsynthase1,chloroplasticc森林草莓F.vescasubsp.vesca5121217965.8036940XP_004293489.1NAD(P)H脱氢酶(醌)FQR1类似蛋白质NAD(P)Hdehydrogenase(quinone)FQR1-like森林草莓F.vescasubsp.vesca

图柱表示蛋白质丰度；线段表示基因表达量图2　五倍体草莓与其十倍体的差异表达蛋白质及其相应基因转录表达量Block diagram. Protein abundance; Line segment. Gene expression levelFig.2　Differentially expressed proteins and their corresponding gene expression levels in FxLs-11-37 and A3 leaves

2.3差异蛋白质相关基因的表达分析

对A3与FxLs-11-37差异蛋白质相应基因进行qPCR表达分析，A3与FxLs-11-37相比，草莓主要过敏原a 1-E蛋白质表达量下降230%，基因相对表达量下降940%；不均一核糖核蛋白1蛋白质表达量下降410%，基因相对表达量下降350%；叶绿体硫辛酰基合酶1蛋白质表达量下降410%，基因相对表达量下降120%；NAD(P)H脱氢酶(醌)FQR1类似蛋白质(简称FQR1)表达量下降280%，基因相对表达量下降140%。4个差异蛋白表达量下降，其相应基因转录表达量也下降，两者趋势相同(图2)。

3　讨　论

多倍体植物因其具有更强的抗逆性，使多倍体育种成为提高植物抗逆性的有效途径[26]。由于杂交及倍性水平的影响，特别是异源多倍体会发生非随机的序列消除现象、偏向性表达以及基因沉默等基因组印记，从而维持新生基因组的稳定和进化[27]。基因组印记的产生，与多倍体形成后的遗传及表观变化有关。在表观遗传上，常通过DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰以及剂量补偿等方式来影响基因表达并产生显著的表型效应[28]。本研究发现，十倍体草莓株系在植株冠径，叶宽叶长、叶片厚度以及叶色等皆超过五倍体草莓株系，叶绿素含量(SPAD值)也较高且具更高的净光合速率，这可能赋予十倍体草莓株系更强的适应性或抗逆性。

植物染色体加倍后，基因的剂量效应和基因互作效应使多倍体植株发生一系列变化，增强多倍体的适应性[26]。草莓主要过敏原a 1-E，作为发育调控防御系统的一部分，参与植物防御反应，是病程相关生物刺激应激反应蛋白质，在正常情况下，植物体内过敏原含量低，在受到病原菌侵染时，过敏原含量会升高；叶绿体硫辛酰合酶1基因可能参与植物抗逆反应，逆境条件下，盐地碱蓬种子内硫辛酰基含量会升高，而在正常状态下，硫辛酰合酶表达量很少[29]，上述这两种蛋白表达量降低可能与十倍体草莓株系抗性或适应性强相关。Avery和Pottorf[30]指出多倍体植株生长发育缓慢可能与生长素含量低导致细胞分裂缓慢有关，FQR1基因受生长素的诱导[31]，当生长素含量低时，FOR1表达量也低，这可能是五倍体草莓加倍而成的十倍体草莓植株生长缓慢的原因之一。

由于双向凝胶电泳本身的局限性，本实验未能检测到更多的差异蛋白质，实际上在其他植物染色体加倍过程中所产生的参与信号传导[32-33]、转录因子[34]和激素代谢[35]等差异蛋白质是广泛存在的，下一步我们将利用新的高通量手段如iTRAQ等技术对草莓染色体加倍前后蛋白质表达的差异进行全面分析，以期更全面了解植物染色体加倍后影响植物表型的相关因素。

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(编辑:宋亚珍)

Differentially Expressed Proteins in Strawberry Leaves between Pentaploid and Its Corresponding Allodecaploid

NING Chuanli, CAI Binhua, WANG Tao, QIAO Yushan*

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Pentaploid strawberry (FxLs-11-37, 2n=5x=35) derived from the hybridization between diploidFragariaviridis(male) and octaploidF. ×ananassa‘Fusanoka’ (female), and its allodecaploid (A3, 2n=10x=70) were employed for conducting proteomic analysis with two dimensional gel electrophoresis technology under observation of agronomic traits, soil and plant analyzer development (SPAD) readings, and the net photosynthetic rate. (1) Compared with FxLs-11-37, A3 showed a significant dwarf type, larger crown, increased leaf length and leaf width, much thicker in leaf, more dark green leaves, and it also has a bigger SPAD for leaf and net photosynthetic rate; (2) Protein spots of FxLs-11-37 and A3 analyzed using PDQuest software were mainly scattered in the isoelectric point ranging from pH 4 to 7, and molecular weight ranging from 14.4 to 66.2 kD. More than 700 expressed protein spots in FxLs-11-37 and A3 were detected. Expression levels of 18 protein spots changed over 1.5 fold after chromosome doubling, and 4 protein spots changed over 2.0 fold. We identified these 4 protein spots with MALDI-TOF-MS/MS mass spectrometry technology, and results showed that the 4 proteins are major strawberry allergen Fra a 1-E, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1, lipoyl synthase 1, chloroplastic, and NAD(P)H dehydrogenase (quinine) FQR1-like. These proteins are involved in stress resistant, mRNA transport, material and energy metabolism. Results of real-time quantitative PCR of gene encoding the above four proteins demonstrated that the difference tendency of gene transcriptional expression was consistent with the proteins levels. We obtained the differentially expressed proteins in strawberry chromosome doubling, which provided tracks for further research.

strawberry; pentaploid; chromosome doubling; differential protein

1000-4025(2016)09-1794-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1794

2016-05-23;修改稿收到日期:2016-09-01

江苏省农业科技自主创新资金(CX(15)1029)

宁传丽(1985-)，女，在读硕士研究生，主要从事草莓生物技术研究。E-mail:2013104032@njau.edu.cn

乔玉山，教授，博士生导师，主要从事果树育种与生物技术研究。E-mail：qiaoyushan@ njau.edu.cn

Q343.2+44; Q591.2; Q753

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