陆地棉GhSAD2基因克隆与表达特征研究

蔡　曼，李卫华，王　娟，王旭文，孔宪辉，余　渝，刘　丽*

(1 石河子大学/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003；2 新疆农垦科学院棉花研究所/农业部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室/国家棉花改良中心新疆生产建设兵团分中心，新疆石河子832000)



陆地棉GhSAD2基因克隆与表达特征研究

蔡曼1，李卫华1，王娟2，王旭文2，孔宪辉2，余渝2，刘丽2*

(1 石河子大学/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003；2 新疆农垦科学院棉花研究所/农业部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室/国家棉花改良中心新疆生产建设兵团分中心，新疆石河子832000)

Δ9硬脂酰 ACP 脱氢酶基因(GhSAD2)是脂肪酸合成代谢过程中关键的去饱和酶基因，为明确该基因在棉花脂肪酸合成代谢中的功能，该研究克隆了陆地棉GhSAD2基因，并对该基因的序列特征、进化关系及表达特性进行分析。序列分析显示，GhSAD2基因(GenBank登录号为KX197920)cDNA全长1 188 bp，编码396个氨基酸，具有脂肪酸去饱和酶家族2个高度保守的组氨酸簇EENRHG和DEKRH，分别位于氨基酸的185和271位。系统进化分析显示，GhSAD2基因与可可树的同源基因进化关系非常接近。qPCR分析显示，GhSAD2基因在叶中的表达量高于茎和根，且在花后25 d的种子中表达量达到最高值。低温胁迫诱导结果表明，GhSAD2基因在不同程度低温处理下均有上调表达，6 h表达量最大，之后逐渐下调。研究表明，GhSAD2基因可能对棉子油不饱和脂肪酸的合成具有重要作用，同时在棉花抗寒方面也起一定的生理作用。

Δ9 硬脂酰 ACP 脱氢酶基因(GhSAD2)；陆地棉；基因克隆；序列分析；低温胁迫

棉花是世界上最重要的纤维作物和主要的油料作物，在中国和世界经济中具有重要地位。陆地棉棉子仁中含有15%～40% 的棉子油[1]，其中亚油酸的含量最高，可达50% 以上，是所有食用油中最高的一种[2]。棉子油除可用作生活食用油、化学工业原料外[3-4]，还是生产生物柴油的理想原料[5]。脂肪酸不仅能为植物储存能量、为种子萌发提供所需的能量，而且也是某些信号分子的前体，在损伤防御和耐寒性等方面有着重要的作用，如膜脂中不饱和脂肪酸的比例和含量与植物的抗寒性密切相关[6-9]。

Δ9-硬脂酰-ACP 脱氢酶(stearoyl- ACP desaturase, SAD)在植物质体中催化硬脂酰-ACP 脱饱和而在脂肪酸链的 C9与C10间引入一个双键形成油酰-ACP的反应，是不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶[10]。因此，SAD 直接决定了植物油脂中的不饱和脂肪酸的总量以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例[11]。在大多数高等植物中，合成SAD的SAD基因在各器官中均有表达，而表达模式存在差异。例如SAD基因在油樟的叶、种子、花中表达量高，而在根和茎中表达量低[12]。而海滨锦葵的SAD基因在叶中表达水平最高，其次是种子，再次是茎和根，花中的表达水平最低。SAD基因在海滨锦葵种子不同阶段的表达水平随种子的发育逐渐降低[13]。花生[14]、蓖麻[15]、油菜[16]、芝麻[17]的SAD基因在各器官中表达模式相似，在发育种子中的表达量比其他组织都高，且在种子发育不同阶段SAD基因的表达存在差异[18]。Liu等[19]通过 RNA干涉使棉花的SAD基因沉默，硬脂酸含量从正常的20%上升到40%，同时还伴随棉籽油中其他3种主要脂肪酸棕榈酸、油酸和亚油酸的减少。Wendy 等[20]将土豆的SAD基因转入烟草，发现叶片和种子的脂肪酸组分发生了变化，不饱和脂肪酸含量增加。Liu[21]等首先在GenBank中注册了陆地棉SAD基因的全长 cDNA 序列(X95988.1)，关于其它品种不同染色体组SAD基因序列特征的研究未见报道。

膜脂相变是植物冷害的原初反应。自Lyons[22]提出植物低温伤害的膜脂相变假说以来，大量实验证明膜脂的不饱和脂肪酸的比例和含量与植物的耐寒性关系密切。一般认为，膜脂不饱和脂肪酸含量增高，膜脂相变温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高。反之，冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低，低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞代谢紊乱。改变膜的流动性有三种机制，即脂肪酸碳链变短、碳链分支和引入双键。前两者只在脂肪酸生物合成过程中实现，而后者则既可以在其生物合成过程中进行，也可以通过去饱和酶对细胞膜内已有的脂肪酸催化来实现。SAD催化的脱氢作用是植物典型不饱和脂肪酸生物合成的第一步，直接影响植物中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例，对植物膜在生理温度下由凝胶态转化为液晶态有重要的作用[23]。将来自拟南芥的一种脂肪酸脱饱和酶基因在烟草中超表达，并在正常温度(25 ℃)下生长；同时将对照烟草在15℃下培养，两种条件下生长的植物的膜脂不饱和脂肪酸含量都增加10%，说明低温可促进不饱和脂肪酸的合成，以适应低温。Vega 等[24]研究发现，4 ℃处理下，马铃薯SAD基因转录水平较对照组(20 ℃)有显著升高，SAD基因的表达与马铃薯的低温适应性有关。目前Liu等关于棉花SAD基因功能的相关报道主要集中在对脂肪酸成分的影响方面，而对SAD基因在棉花抗寒性方面的作用研究甚少。

本研究以棉花‘新陆早33号’品种为材料，采用电子拼接和RT-PCR方法克隆GhSAD2基因cDNA全长，GenBank登录号为KX197920。利用NCBI和DNAMAN分析软件，对该基因进行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析，并构建系统进化树，以分析该基因在不同物种间的进化关系；并对该基因的氨基酸序列、组织表达特异性及低温胁迫下的表达特性进行了分析，以期为遗传改良棉籽油品质、提高棉花抗逆性等提供理论指导。

1　材料与方法

1.1材料

2014年在新疆农垦科学院试验地种植‘新陆早33号’，开花期在植株中上部同一部位挂牌自交，采集盛花期后10、15、20、25、30、35、40和45 d的胚珠，用于测定基因的表达量。根、茎、叶取自生长在28℃(16 h/8 h)的光照培养箱中长出 2～3 片真叶的棉花幼苗，用于测定基因组织表达。所有试验材料取样后迅速置液氮中，在-70℃冰箱保存，用于RNA提取。

胁迫处理：从温度25 ℃/16 ℃(16 h/8 h)，光照培养箱取长出 2～3片真叶、长势相同的‘新陆早33号’幼苗，进行不同温度的胁迫处理。具体操作如下：将棉花幼苗置于5 ℃、15 ℃、25 ℃的培养箱中，分别在处理1、3、6、12、24 和 48 h 后进行叶片取样，迅速置于液氮后，-70 ℃保存，用于RNA提取。

所有室内试验在新疆农垦科学院农业部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室内完成。

1.2方法

1.2.1RNA提取及cDNA 链的合成用CTAB法[25]提取棉花叶片总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性； 用核酸蛋白分析仪测定其A260、A280值，计算RNA浓度和纯度。反转录之前，RNA样品用DNase I(Takara，日本)处理。以3.5 μL RNA 为模板按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit (Takara，日本)描述的方法，合成 cDNA第一链。具体过程如下:5×PrimerScript Buffer 2 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL, RNase-Free ddH2O 3 μL，充分混匀，37 ℃孵育15 min进行反转录反应，85 ℃孵育5 s反转录酶失活，置于4 ℃备用或-20 ℃保存。

1.2.2GhSAD2基因的扩增根据中国农业大学遗传育种实验室构建的棉花脂肪酸 cDNA 文库，对文库进行分析后，从文库中选取1个可能与脂肪酸去饱和酶基因(SAD)相关的 cDNA 序列，将其在NCBI 的棉花EST 数据库中进行比对，下载一致性高的 EST 用 CAP3 Sequence assembly进行拼接，用ORF finder预测ORF区，分别设计全长 ORF 引物和 RT-PCR 引物(表1)进行目标基因全长 ORF 验证和表达特征分析，PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。提取‘新陆早33号’叶片中的总RNA，并反转录为 cDNA 作模板用Pfu高保真酶(全式金，北京)进行 PCR 扩增，PCR 条件为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，61.4 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，目的条带经胶回收、纯化(方法参见天根胶回收试剂盒说明书)后连接至 pMD19-T (Takara，日本)载体上，热激法转化大肠杆菌Trans1-T1(全式金，北京)，蓝白斑筛选挑取阳性单克隆、摇菌，选取3个阳性克隆送往上海生工生物工程有限公司进行测序；采用 Blast 程序(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析序列的同源性；用 DNAMAN软件进行序列翻译和多重比对；利用在线 CDD 软件 ( http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd.shtml) 分析棉花GhSAD2 基因的保守结构域(Ferritin-like domain)。

1.2.3生物信息学分析利用下列在线软件对氨基酸序列进行结构特征分析：蛋白等电点、分子量等分析软件(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)，蛋白二级结构分析软件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)， 蛋白保守结构域分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)，亚细胞定位软件 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP)，信号肽预测软件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)， 蛋白质三级结构分析软件(http://swissmodel.expasy.org/interactive)。系统进化树采用Clustalw1.83软件对GenBank中不同物种的SAD基因进行多序列比对分析，创建一个不同来源的SAD2基因的多序列的比对结果；系统发生和进化分析在比对的基础上用 MAGE5.0软件完成，系统进化树采用邻接法构建。

1.2.4GhSAD2 基因的表达分析以‘新陆早33号’根、茎、叶和花后不同时间的胚珠为材料，分别以它们的 cDNA 为模板，选用UBQ7基因为内参。根据所克隆的GhSAD2 基因的编码序列设计定量PCR的引物(表 1)，扩增目的片段为1 182 bp，引物特异性由PCR产物的熔解曲线单一峰确定。反应用TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金)在Roche LightCycler 480荧光定量 PCR 仪上进行。反应体系为20 μL，包括TransStart Tip Green qPCR SuperMix (2×) 10 μL、10 μmol/L GhSAD2-q上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 1 μL，加 ddH2O至20 μL。qPCR 程序为 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性10 s， 56 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环；95 ℃ 1 min，40 ℃～95 ℃ 2 min做溶解曲线，40 ℃降温30 s。设3个技术重复，数据输出的结果用Microsoft Excel软件进行处理。

2　结果与分析

2.1GhSAD2基因的克隆及序列分析

利用设计的GhSAD2F和GhSAD2R引物(表1)，对‘新陆早33号’叶片中cDNA 进行 PCR 扩增电泳结果表明有一长约1.2 kb的扩增条带(图1)，符合预期扩增片段长度。将特异条带切胶回收后连接PMD19-T vector，转化Trans1-T1感受态细胞后，用蓝白斑筛选阳性克隆送往测序公司进行序列测定。其测序结果通过DNAStar和DNAMAN分析，

M.DL2000； 1～7.GhSAD2的cDNA片段图 1　陆地棉SAD2基因的克隆M.DL2000；1-7. cDNA gene fragment of GhSAD2Fig.1　cloned gene SAD2 of Gossypium hirsutum

进行BLASTP比对，确定其为cDNA全长，包括完整的开放阅读框(open reading frame，ORF)。cDNA全长为1 188 bp，编码396个氨基酸，将该基因命名为GhSAD2，GenBank登录号为KX197920。

利用ExPASy分析显示，该基因的理论分子量为45.3 kD，理论等电点为5.88，平均亲水系数(GRAVY)为-0.464，属于亲水性蛋白。用Target P1.1 Server对棉花GhSAD2基因编码的氨基酸序列进行预测的结果表明，该序列含有叶绿体转运肽(用 C 表示)、线粒体目标肽(用M表示)、 分泌途径信号肽(用S表示)与其它，分值分别为0.616、0.204、0.079及0.043，预测可靠性为3级，无氨基酸残基分裂位点，有叶绿体转运肽，导肽长度为34。蛋白质二级结构预测结果显示，GhSAD2中α螺旋占54.82%，无规则卷曲占38.25%，β折叠占6.93%；通过SWISS-MODEL同源建模法获得GhSAD2 的理论三维结构(图2)，一致性为90.86%，为同型二聚体，含一个属于酰基 ACP 脱氢酶家族和属于类铁蛋白家族的保守结构域。位于SAD保守区的 4个螺旋结构中埋藏着一个由2个铁原子组成的二铁中心，铁原子的配基为E137、E175、H178、E261。

图 2　棉花GhSAD2理论三维结构Fig.2　Theoretical three-dimensional structure of GhSAD2表1　基因扩增的引物Table 1　Primer sequence for gene amplification

引物名称Primer引物序列Primersequence(5'→3')Tm/℃说明IntroductionGhSAD2FATGGCTCTGAAATTCAACCC61.4GhSAD2基因扩增GhSAD2RGAGCTGGACTTCTCTATCAAAT61.4GhSAD2geneamplificationqSAD2FGCCTTTCATGCCTCCTAGC56荧光定量qSAD2RGTTGTTCTCAGCCCAGTCC56qPCRUBQ7FGAAGACCTACACCAAGCCCAAG56荧光定量内参UBQ7RCGGACTCTACTCAATCCCCACC56qPCRactin

用Blast将该基因与其他植物SAD2氨基酸序列同源比对，图3表明，GhSAD2与已经发表的陆地棉SAD基因的相似性为83%，与已经克隆得到的大豆、可可、拟南芥及小麦的相似性分别为84.6%、80.1%、76.3%、75.0%；同时利用 NCBI 数据库中在线CDD 软件对该基因的保守结构域进行分析，发现该基因属于类铁氧化还原蛋白超家族，具有酰基-ACP 脱氢酶保守结构域，保守域为67～373，包括14个底物结合位点，多个二聚体形成位点和用于催化Fe2+中心的6个活性位点，该酶在同型二聚体状态下保持活性，并且单体主要由α-螺旋和催化 Fe2+中心的4 个螺旋束组成，该中心具有催化酰基-ACP上第9个和10个碳原子上的H与O2-结合，形成不饱和键。从相似性比对的结果可以看出，SAD基因在不同物种间的同源性很高，所有SAD基因的核心区段几乎完全相同，仅在起始密码子和终止密码子附近有较大的差异。本研究克隆得到的GhSAD2基因编码的蛋白具有脂肪酸去饱和酶家族2个高度保守的组氨酸簇-EENRHG和DEKRH，分别位于氨基酸的185和271位，推测其可能具有SAD家族类似的功能，该分析进一步验证了本研究从陆地棉中克隆得到GhSAD2 基因。

2.2GhSAD2的系统进化树分析

利用BLASTP对该基因预测蛋白的氨基酸序列进行同源性检索，并下载同源性较高的物种氨基酸序列，用Clustalw1.83和MEGA5.0构建SAD基因家族成员的系统发育树(图4)。结果显示，整个进化树分为2支，其中大豆、文冠果、苜蓿等分为一大支，棉花和可可分为一小支。GhSAD2基因和已经发表的陆地棉的SAD基因聚于同一个小的进化分支，亲缘关系最近，同时与可可树的同源基因进化关系非常接近。这与该物种在经典分类学上的地位相一致，棉花和可可树同属被子植物门、双子叶植物纲、锦葵目。

GhSAD2(KX197920)和GhSAD1(X95988.1). 棉花; GmSAD2(NM001251615.1).大豆; TcSAD2(XM 007033671.1).可可; AtSAD2(NM129933.3).拟南芥; TaSAD2(HQ589253.1).小麦；黑框表示SAD基因保守的氨基酸序列图3　GhSAD2 基因的氨基酸序列比对分析GhSAD2(KX197920) and GhSAD1(X95988.1) are from G. hirsutum; GmSAD2(NM001251615.1) is from Glycine max; TcSAD2(XM 007033671.1) is from Theobroma cacao; AtSAD2(NM129933.3) is from Arabidopsis thaliana; TaSAD2(HQ589253.1) is from Triticum aestivum. The coserved SAD homologeis indicated in blackFig.3　Alignment of amino acid sequences of SAD2 genes of G. hirsutum

图中各节处数字表示重复1 000次Bootstrap值图4　GhSAD2 基因的系统进化树The numbers at note represent the Bootstrap values with 1 000 replicates in this figureFig.4　Phylogenetic tree of GhSAD2 genes

图 5　GhSAD2基因在棉花各组织中的表达Fig.5　GhSAD2 expression in the leaf,stem and root of G. hirsutum

2.3GhSAD2基因的组织表达分析

分别以‘新陆早33号’棉花幼苗2～3片真叶的根、茎、叶及盛花期后10、15、20、25、30、35、40和45 d胚珠的总RNA为模板，以持家基因UBQ7为内参基因。通过 qRT-PCR 研究GhSAD2基因在棉花幼苗根、茎、叶等组织的相对表达量(图5)，及在棉花种子发育不同时期的表达情况(图6)。结果显示，GhSAD2基因在叶的表达量高于茎和根中的表达量；GhSAD2基因在花后种子发育过程中呈现先上升后下降的趋势，在花后25 d的种子中达到最高值，随后逐渐降低，在成熟的种子(花后45 d时)表达相对微弱。GhSAD2基因是不是影响棉子油中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的关键基因，还有待进一步研究。

图6　GhSAD2基因在棉花种子发育不同时期的表达Fig.6　GhSAD2 expression in different seed development stages of G. hirsutum

图 7　GhSAD2基因在不同温度胁迫下相对表达量Fig.7　GhSAD2 gene relative expression levels under temperature stress

2.4GhSAD2基因在低温胁迫下的表达分析

通过对不同温度不同时间的胁迫处理下GhSAD2基因的qRT-PCR分析(图7)，25 ℃作为对照组，GhSAD2基因在棉花叶片中的相对表达量基本保持恒定，无显著性的上升或下降。在5 ℃和15 ℃处理下，GhSAD2基因的相对表达量稳步上升，从1 h 后开始逐步增加，到6 h时达到高峰，表达量为25 ℃对照组的2.7～6.0倍;随后逐渐降低，在12 h的处理后，GhSAD2基因的表达量基本保持稳定，在24和48 h时其表达量是对照组的1.3～2.3倍。研究结果表明，GhSAD2基因能够在低温胁迫下应答，在短时间内表达量会有所上调，表明GhSAD2基因可能在棉花冷胁迫调控中起一定的作用。

3　讨　论

Δ9 硬脂酰-ACP 去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是目前研究最多、最广泛的膜质去饱和酶，该酶催化的反应是在第 9～10 碳原子之间脱氢形成第一个双键。通常 SAD在质体中催化硬脂酸去饱和产生油酸，然后以脂形式存在的油酸被运转到类囊体膜中或进入细胞质中进一步去饱和[26]。迄今为止，它是高等植物中唯一的脂溶性脱氢酶，因此，关于植物脂质去饱和的研究已经成为生物化学研究中的热点。

目前已从多种植物中分离获得SAD基因的 cDNA。其中油菜、芝麻、油茶、麻风树等大多数油料作物SAD基因的 ORF 长 1 173～1 197 bp，编码 390～398个氨基酸，本研究获得的陆地棉的SAD基因cDNA全长分别为1 188 bp，396个氨基酸。通过氨基酸序列比对及系统进化树分析，GhSAD2基因与陆地棉SAD1基因的cDNA全长序列(X95988.1)相似性最高，亲缘关系最近，推测两基因可能在调控植物生长方面的功能比较接近。利用实时荧光定量PCR，GhSAD2基因在棉花的组织中都有表达，且在花后25 d 种子中表达量最大，说明该基因在脂肪酸合成过程中都起到了脱氢酶的作用。Liu等[21]通过 RNA干涉使棉花的SAD基因沉默，硬脂酸含量从正常的20%上升到40%，同时还伴随棉籽油中其他3种主要脂肪酸棕榈酸、油酸和亚油酸的减少。对于本研究克隆得到的GhSAD2基因在调节脂肪酸含量是否与之前得到的基因有类似的功能需要进一步进行验证。

Lindqvist 等[26]用 X-射线晶体衍射分析描述了蓖麻SAD基因的晶体结构，张党权等[27]通过同源建模法获得油茶SAD基因的理论三维结构，均为同型二聚体，亚基含有11个α-螺旋，其中9个α-螺旋形成一个反平行螺旋束，该螺旋束上的4个α-螺旋与 Fe2+共同形成 SAD的活性中心。本研究通过同源建模获得GhSAD2蛋白的同型二聚体，发现其具有植物SAD的空间结构特征。这为进一步从蛋白水平研究棉花GhSAD2基因的功能奠定了基础。

SAD在质体中催化硬脂酸去饱和产生油酸，然后油酸以脂的形式被运转到类囊体膜中或进入细胞质中进一步去饱和。大量研究表明当植物受到温度胁迫时主要是通过改变不饱和脂肪酸含量和比例来提高植物的抗寒性，因此SAD基因对于植物的低温响应具有十分重要的作用。Cheesbrough等[28-29]研究发现，长在20℃的大豆的SAD基因活性比生长在35 ℃的大豆的SAD基因活性高5倍。Polashock J等[30]和 Ma J 等[31]分别将酵母的SAD基因和菠菜的SAD基因导入烟草，结果显示转基因烟草的抗寒性均增强。银杏的GbSAD基因在4 ℃和15 ℃处理下该基因的水平稳步上升，从1 h后表达增加，到3和6 h表达达到高峰，相比对照(25 ℃)增长40～50倍，然后逐步下降到48 h表达量为对照组的2～4倍[32]，本研究中GhSAD2基因与银杏GbSAD基因在低温胁迫下呈现相同的表达趋势。但对于15 ℃的中度胁迫下的表达量始终高于5 ℃的高度胁迫，可能是中度胁迫更有利于GhSAD2的表达，对于GhSAD2基因在棉花抗寒中的具体作用，有待进一步研究。

通过转基因手段改良棉花脂肪酸成分及抗寒性是一项意义重大的工作，下一步我们将构建过表达载体和干扰载体，通过转基因进一步研究该基因在不饱和脂肪酸合成过程中及棉花抗寒中的具体作用。

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(编辑:宋亚珍)

Molecular Cloning and Expression Analysis of Stearoyl-ACP Desaturase Gene(GhSAD2)in Upland Cotton (GossypiumhirsutumL.)

CAI Man1, LI Weihua1, WANG Juan2, WANG Xuwen2, KONG Xianhui2, YU Yu2, LIU Li2*

(1 Shihezi University/The Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi， Xinjiang 832003, China; 2 Cotton Institute, Xinjiang Academy Agricultural and Reclamation Science / Northwest Inland Region Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding (Xinjiang), Ministry of Agriculture, China / Xinjiang Production & Construction Corps / Subcenter of National Cotton Improvement Center, Ministry of Agriculture, China, Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Δ9 stearoyl ACP desaturase gene (GhSAD2) is a fatty acid synthesis and metabolism in the process of key desaturase gene. To clarify the gene function in biosynthesis of cotton fatty acids, we cloned theGhSAD2 gene from upland cotton, and analyzed the gene sequence features, evolutionary relationship and expression characteristics. In this study, a full-length cDNA of stearoyl-ACP desaturase gene was cloned from upland cotton ‘Xinluzao 33’ leaves successfully by using electronic stitching and RT-PCR, which namedGhSAD2 and access number was KX197920 in GenBank. The gene nucleotide and amino acid sequences were analyzed by using NCBI and DNAMAN and a phylogenetic tree was constructed by using Clustalw 1.83 and MAGE 5.0 software, which would help analyze the gene evolutionary relationships among different species. Result showed that theGhSAD2 gene open reading frame had 1188bp, encoding a polypeptide of 396 amino acids. Sequence analysis revealed that this geneGhSAD2 had two highly conserved histidine clusters of ferritin-like superfamily: EENRHG and DEKRH were located at amino acid 185 and 271. Phylogenetic analysis showed thatGhSAD2 homologous gene evolutionary relationship with the cacao tree is very close, which is consistent with the status of the species in the classical taxonomy. qPCR showed thatGhSAD2 inG.hirsutumhad a much higher expression in leaves than that in stems and roots.GhSAD2 express highest at 25 days (s25) after flowering seed.GhSAD2 in leaves expression under cold stress analysis showed that the gene were upregulated under varying low temperature treatments. It has the highest expression at 6 hours treatment, and then gradually reduced. Studies have shown thatGhSAD2 gene may play an important role at cotton seed oil unsaturated fatty acid synthesis. At the same time, it has a certain physiological role in the cold resistance of cotton.

stearoyl-ACP desaturase gene;Gossypiumhirsutum; gene clone; sequencing analysis; low temperature stress

1000-4025(2016)09-1713-08doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1713

2016-05-26;修改稿收到日期:2016-09-02

国家自然科学基金(31360349)

蔡曼(1992-)，女，在读硕士研究生，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：1660115973@qq.com

刘丽，博士，副研究员，主要从事棉花遗传育种研究。E-mail:cottonliuli@sina.com

Q785; Q789

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